КОФЕ И КОФЕЙНЫЕ ПРОДУКТЫ

Определение содержания кофеина с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Стандартный метод

ISO

Coffee and coffee products - Determination of the caffeine content using high performance liquid chromatography (HPLC) – Reference method

(IDT)

Настоящий проект стандарта не подлежит применению до его утверждения

2012

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Некоммерческой организацией «Российская Ассоциация производителей чая и кофе «РОСЧАЙКОФЕ» (Ассоциация «РОСЧАЙКОФЕ») на основе аутентичного перевода на русский язык указанного в п. 4 стандарта, который выполнен »

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Евразийским советом по стандартизации, метрологии и сертификации

За принятие голосовали

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО «Кофе и кофейные продукты. Определение содержания кофеина с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). » (ISO «Coffee and coffee products - Determination of the caffeine content using high performance liquid chromatography (HPLC) – Reference method »).

В текст стандарта внесены редакторские изменения, связанные с необходимостью применения общепринятых терминов.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

6 Некоторые элементы настоящего стандарта могут являться объектом патентных прав

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в указателе "Национальные стандарты".

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе "Национальные стандарты", а текст изменений - в информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе "Национальные стандарты".

Содержание

1 Область применения ……………………………………………

2 Нормативные ссылки …………………..………………………

3 Принцип …………….………………………………………......

4 Реактивы …………………….…………………………………

5 Оборудование ………………….………………………………

6 Отбор пробы ………………….…………………………….……

7 Подготовка пробы ……….………………………………………

8 Процедура проведения анализа …………………………..……

9 Обработка результатов ….………………………………..……

10 Прецизионность ……….………………………………………

11 Протокол испытаний …….………………………………..……

Приложение A (справочное). Данные о прецизионности на основе межлабо-

раторных испытаний по определению содержания кофеина в кофе и кофейных продуктах ………

Приложение ДА (справочное) Сведения о соответствии ссылочных междуна-

родных стандартов ссылочным межгосударственным стандартам ……………

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

КОФЕ И КОФЕЙНЫЕ ПРОДУКТЫ

Определение содержания кофеина с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Стандартный метод

Coffee and coffee products. Determination of the caffeine content using high performance liquid chromatography. Reference method

Дата введения

1 Область применения

Настоящий международный стандарт устанавливает метод с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения содержания кофеина в зеленом, жареном и растворимом кофе, в том числе декофеинизированном, а также в растворимых кофейных продуктах (например, смесь кофе/цикорий или кофейный напиток типа капучино).

2 Нормативные ссылки

Следующие ссылочные нормативные документы являются обязательными при применении данного документа.

ИСО 3696 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний

ИСО 3726 Кофе растворимый. Определение потери массы при 70 град. С и пониженном давлении

ИСО 6673 Кофе сырой. Определение потери массы при температуре 105 град. С

ИСО 11817 Кофе жареный молотый. Определение массовой доли влаги. Метод Карла Фишера (эталонный метод)

3 Принцип

Кофеин экстрагируют из проб водой при 90 °C в присутствии оксида магния. После фильтрации содержание кофеина в экстракте определяют методом ВЭЖХ на колонке RP-18, применяя изократическое элюирование с ультрафиолетовым детектированием приблизительно при 272 нм.

При необходимости содержание кофеина может быть выражено на основе массы сухого вещества, для чего требуется определение влаги подходящим стандартным методом.

4 Реактивы

Если не установлено иное, то следует использовать только реактивы признанной аналитической чистоты и только воду, соответствующую требованиям ИСО 3696, класс 1.

4.1 Метанол, класса для ВЭЖХ.

4.2 Оксид магния (MgO), тяжелый, высокой чистоты [1]) .

Примечание - Использование MgO существенно для срока службы аналитической колонки, особенно для зеленого кофе. Количество используемого MgO зависит от оборудования и от типа кофейного продукта.

Данные о прецизионности в приложении A были получены с использованием процедуры, описанной в настоящем стандарте.

Появление интерферирующих пиков на хроматограмме может быть обусловлено неправильной адсорбцией. В этих случаях используемый MgO подлежит проверке.

4.3 Кофеин (1,3,7-триметилксантин; 1,3,7-триметил-1H-пурин-2,6(3H,7H)-дион; метилтеобромин; C8H10N4O2), чистый безводный.

4.4 Подвижная фаза, 24% (об.) водный раствор.

Меры предосторожности - Следует использовать перчатки, средства защиты глаз и готовить реактивы в вытяжном шкафу.

Переносят 240 см3 метанола (4.1) в мерную колбу емкостью 1 дм3 с одной меткой (5.11). Дополняют водой до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.2).

Примечание - Изменяя отношение метанола и воды, можно регулировать время удерживания кофеина с целью оптимизации хроматографического разделения на используемой колонке.

4.5 Стандартные растворы кофеина

4.5.1 Исходный раствор, соответствующий концентрации 200 мг/дм3.

Отвешивают (0,200 ± 0,001) г безводного кофеина (4.3) в мерную колбу емкостью 1 дм3 (5.11). Добавляют достаточное количество теплой воды до половины объема колбы. Перемешивают до полного растворения кофеина, охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки водой и перемешивают.

Раствор устойчив при +4 °C в течение месяца. Хранить в холодильнике.

4.5.2 Разбавленный стандартный раствор для обычного кофе, соответствующий концентрации приблизительно 40 мг/дм3.

С помощью пипетки (5.12) помещают 50 см3 стандартного исходного раствора кофеина (4.5.1) в мерную колбу емкостью 250 см3 (5.11). Доводят водой до метки и перемешивают. Готовят свежий стандартный раствор ежедневно.

4.5.3 Разбавленный стандартный раствор для декофеинизированного кофе, соответствующий концентрации приблизительно 4 мг/дм3.

С помощью пипетки (5.12) помещают 5 см3 стандартного исходного раствора кофеина (4.5.1) в мерную колбу емкостью 250 см3 (5.11). Доводят водой до метки и перемешивают. Готовят свежий стандартный раствор ежедневно.

4.5.4 Калибровочная кривая.

Для построения калибровочной зависимости используют от трех до пяти точек. Рекомендуется интервал концентраций от 5 мг/дм3 до 25 мг/дм3 для обычного кофе и от 0,5 мг/дм3 до 2,5 мг/дм3 для декофеинизированных проб.

5 Оборудование

Используют обычное лабораторное оборудование, в частности

5.1 Аналитические весы, обеспечивающие взвешивание с точностью ± 0,1 мг.

5.2 Мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм для фильтрации подвижных фаз и разбавленных экстрактов проб.

5.3 Высокоэффективный жидкостный хроматограф, обеспечивающий выполнение изократического элюирования, оснащенный УФ детектором, установленным на 272 нм (от 270 нм до 280 нм), или фильтровым детектором (254 нм), а также системой сбора/интеграции данных. Использование дегазатора не является обязательным.

5.4 Хроматографическая колонка для ВЭЖХ минимальной длины 125 мм, заполненная материалом C18 с размером сферических частиц предпочтительно 5 мкм, с эффективностью разделения как минимум 5000 теоретических тарелок. Число теоретических тарелок N может быть рассчитано исходя из формы пика, полученного при вводе стандартного раствора кофеина (4.7) по формуле (1):

,

где

tr – время удерживания пика, в секундах,

b – ширина пика на половине высоты, в секундах.

5.5 Магнитная мешалка с нагревателем и установленной водяной баней.

5.6 Ультразвуковая ванна.

5.7 Микролитровый шприц.

5.8 Кофемолка, пригодная для размола зерен жареного кофе.

5.9 Мельница с зубчатым колесом и с охлаждающей рубашкой, или лабораторная мельница с лопастями и охлаждающей рубашкой, или любой другой прибор, подходящий для размола зерен зеленого кофе.

5.10 Сито с номинальным размером отверстий 630 мкм, соответствующая требованиям ИСО 565[2], серия R20.

5.11 Мерные колбы с одной меткой, емкостью 1дм3 и 250 см3, соответствующие требованиям ИСО 1042 [4], класс A.

5.12 Пипетки, емкостью 50 см3 и 5 см3, соответствующие требованиям ИСО 648 [3], класс A.

6 Отбор пробы

В лабораторию должна быть отправлена репрезентативная проба. Повреждения или изменения во время транспортировки или хранения недопустимы.

Отбор проб настоящим стандартом не устанавливается. Процедура отбора проб должна быть согласована заинтересованными сторонами.

Пробу для анализа следует хранить таким образом, чтобы были предотвращены любые повреждения и изменения состава.

Для испытания продуктов из порошковых смесей требуется как минимум 50 г продукта (для порционных упаковок: минимум пять порций).

7 Подготовка пробы

7.1 Зеленый кофе

Зерна зеленого кофе (5.9) размалывают, так чтобы более 50 % массовой доли пробы проходило через сито (5.10). Затем берут пробу для анализа из всего хорошо перемешанного размолотого кофе.

7.2 Жареный кофе

Зерна жареного кофе (5.8) размалывают, так чтобы более 50 % массовой доли проходило через сито (5.10).). Жареный молотый кофе в торговых упаковках используется без дальнейшей обработки, за исключением гомогенизации.

7.3 Растворимый кофе

Размалывание для растворимого кофе не требуется.

7.4 Смешанные напитки

Кофейные напитки из порошковых смесей гомогенизируют, используя мельницу (5.8), непосредственно перед экстрагированием, для того чтобы предотвратить разделение.

8 Процедура проведения анализа

8.1 Определение сухого вещества в кофе (необязательное, см. 9.2)

Рассчитывают содержание сухого вещества в кофе, значение которого будет использовано в 9.2, на основе содержания влаги, определенного на анализируемой пробе (Раздел 7) в соответствии с

⎯ ИСО 6673 для зеленого кофе,

⎯ ИСО 11817 для жареного кофе,

⎯ ИСО 3726 для растворимого кофе.

Для других типов кофе и кофейных продуктов процедура определения содержания сухого вещества должно согласовываться между заинтересованными сторонами.

8.2 Проба для анализа

8.2.1 Жареный и зеленый кофе

На аналитических весах (5.1) взвешивают приблизительно 1 г пробы для анализа (7.1, 7.2) с точностью до миллиграмм и помещают в мерную колбу емкостью 250 см3 (5.11).

8.2.2 Растворимый кофе

На аналитических весах (5.1) взвешивают приблизительно 0,5 г пробы для анализа (7.3) с точностью до миллиграмм и помещают в мерную колбу емкостью 250 см3 (5.11)

8.2.3 Смешанные напитки

На аналитических весах (5.1) взвешивают приблизительно 1 г пробы для анализа (7.4) с точностью до миллиграмм и помещают в мерную колбу емкостью 250 см3 (5.11)).

8.3 Экстрагирование кофеина

В колбу, содержащую пробу для анализа (8.2.1, 8.2.2 или 8.2.3), добавляют 5 г оксида магния (4.2) и около 200 см3 воды. Помещают колбу на водяную баню, функционирующую при температуре кипения, и ждут, пока раствор не достигнет температуры как минимум 90 °C. Продолжают нагревание колбы в водяной бане 20 мин, перемешивают время от времени, покачивая или встряхивая. Снимают мерную колбу с водяной бани, охлаждают до комнатной температуры водопроводной водой и восполняют объем водой. Ждут, пока не произойдет осаждение твердого вещества.

Берут аликвоту раствора и фильтруют через фильтр с порами 0,45 мкм (5.2), отбрасывая первые несколько миллилитров. Полученный фильтрат готов для разделения методом ВЭЖХ.

8.4 Проведение анализа

8.4.1 Настройка оборудования

Примечание - Подвижную фазу перед использованием следует дегазировать в течение 20 мин в ультразвуковой ванне (5.6) или продувают гелием. Если хроматограф оборудован дегазатором, достаточно 10 мин.

Готовят хроматограф (5.3) в соответствии с инструкциями изготовителя и устанавливают следующие параметры хроматографического разделения:

- скорость потока подвижной фазы (4.4): 1,0 см3/мин;

- УФ детектор устанавливается на длину волны 272 нм (254 нм при использовании фильтрового детектора). Необходимо обеспечить, чтобы диапазон чувствительности детектора соответствовал пику стандартного раствора (при использовании нескольких стандартных растворов – максимальному пику).

8.4.2 Хроматографический анализ

Как только скорость потока подвижной фазы и соответствующее давление становятся стабильными, оставляют систему как минимум на 10 мин для достижения равновесия. Затем вводят 10 мкл стандартного раствора в колонку, используя микролитровый шприц (5.7), с последующим введением равного объема экстракта пробы для анализа (8.3). При использовании одного стандартного раствора, его вводят с регулярными интервалами (обычно после шести экстрактов пробы). После каждой серии анализа тщательно промывают хроматографическую систему и колонку метанолом 50 % (об.) (4.1) и водой и устанавливают на колонку заглушки, если они удалялись.

9 Обработка результатов

9.1 Содержание кофеина в пробе

Вычисляют содержание кофеина, wc, выраженное в процентах по массе, численно эквивалентное граммам на 100 г кофе по формуле (2):

, (2)

где

Ast – площадь пика, полученного для стандартного раствора кофеина, в произвольных единицах;

Ad – площадь пика, полученного для анализируемого раствора, в произвольных единицах;

ms – масса пробы, в граммах;

V – объем экстракта, определенный в 8.2, в дм3 (V = 0,25 дм3)

ρst – концентрация стандартного раствора кофеина, в г/дм3;

Примечание - Высоту пика можно использовать как альтернативу площади пика.

Если используется более одного калибровочного стандарта, строят линейный калибровочный график для стандарта кофеина, чтобы получить значение угла наклона и точки пересечения. Этот калибровочный график используется для вычисления концентрации кофеина в пробе.

В качестве результата берут арифметическое среднее двух определений при соблюдении условия повторяемости (10.2).

9.2 Определение содержания кофеина в пробе на основе массы сухого вещества (необязательное, см. 8.1)

Вычисляют содержание кофеина, w’c , выраженное в процентах по массе, численно эквивалентное граммам на 100 г, на основе сухого вещества по формуле (3):

, (3)

где

wd - содержание сухого вещества в пробе (в граммах на 100 г), определенное в соответствии с 8.1.

В качестве результата берут арифметическое среднее двух определений при соблюдении условия повторяемости (10.2).

10 Прецизионность

10.1 Межлабораторные испытания

Подробности межлабораторных испытаний для определения прецизионности метода приведены в Приложении A.

Пределы повторяемости и воспроизводимости, по ИСО 5725-1:1994[5] (пп. 3.16 и 3.20 соответственно), определены по ИСО 5725-6:1994 (п. 4.1.4) [7].

Для оценки предела воспроизводимости по Горвитцу использовали функцию Горвитца [9].

Значения, полученные в этом межлабораторном испытании, не применимы к другим интервалам концентраций и образцам.

Данные о прецизионности по ИСО 5725-1[5] приведены в Таблице 1.

Т а б л и ц а 1 – Средние значения, пределы повторяемости и воспроизводимости

10.2 Повторяемость

Абсолютное значение разности двух независимых испытаний, проведенных с использованием одного и того же метода и на одном и том же испытуемом материале в одной и той же лаборатории на одном и том же оборудовании одним и тем же оператором в течение небольшого промежутка времени, не должно превышать значений предела повторяемости r, приведенных в таблице A.1, более чем в 5 % испытаний.

10.3 Воспроизводимость

Абсолютное значение разности двух независимых испытаний, проведенных с использованием одного и того же метода и на одном и том же испытуемом материале в различных лабораториях на различном оборудовании разными операторами не должны превышать значений предела воспроизводимости R, приведенных в таблице A.2, более чем в 5 % испытаний.

11 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать:

информацию, необходимую для идентификации пробы;

информацию о методе испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

результаты испытаний;

полученный окончательный результат, если проводилась проверка повторяемости;

детали испытания, не установленные в данном международном стандарте, или считающиеся необязательными, а также подробности всех обстоятельств, которые могут повлиять на результат;

.

Приложение A (справочное). Данные о прецизионности на основе межлабораторных испытаний по определению содержания кофеина в кофе и кофейных продуктах

Т а б л и ц а A. 1 – Данные о прецизионности межлабораторного испытания для определения кофеина в кофе и кофейных продуктах

Приложение ДА

Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов ссылочным межгосударственнным стандартам

Таблица ДА.1

Библиография

[1] ИСО 30:1992, Термины и определения, используемые в области стандартных образцов

[2] ИСО 565, Сита контрольные. Проволочная ткань, перфорированные пластины и листы, изготовленные гальваническим методом. Номинальные размеры отверстий

[3] ИСО 648, Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной меткой

[4] ИСО 1042, Посуда лабораторная стеклянная. Мерные колбы с одной меткой

[5] ИСО 5725-1:1994, Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Общие принципы и определения

[6] ИСО 5725-2:1994, Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод для определения повторяемости и воспроизводимости

стандартного метода измерений

[7] ISO 5725-6:1994, Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

[8] ISO 20938, Кофе быстрорастворимый. Определение содержания влаги. Метод Карла Фишера (Контрольный метод)

[9] M. Thompson, S. L. R. Ellison, R. Wood, FOR THE INTERDIVISIONAL WORKING PARTY FOR HARMONIZATION OF QUALITY ASSURANCE SCHEMES. The International Harmonized Protocol for the proficiency testing of

analytical chemistry laboratories: IUPAC Technical Report. Pure Appl. Chem. 2006, 78, pp. 145-196 Available () at: http://www. iupac. org/publications /pac/2006/pdf/7801x0145.pdf

[10] W. Horwitz, R. Albert, The Horwitz ratio (HorRat): A useful index of method performance with respect to precision. J AOAC Int. 2006, 89, pp.

________________________________________________________________

УДК 663.93 МКС 67.140.20 IDT

Ключевые слова: кофе, метод определения содержания кофеина

[1] ) Merck 105867 является примером продукции, имеющейся в продаже. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой данной продукции со стороны ИСО.