Клинико-диагностическое значение определения антител к эластину и эластазе у больных системной склеродермией с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента

На правах рукописи

А В Е Т И С О В А Элина Рафаэловна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЭЛАСТИНУ И ЭЛАСТАЗЕ
У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИЕЙ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЫ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМОГО СОРБЕНТА

14.01.22 Ревматология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Волгоград – 2013

Основные задачи исследования

1.  Применяя иммобилизированные формы эластина и эластазы, изучить распространенность и концентрацию антител к эластину и эластазе в сыворотках крови здоровых лиц, больных системной склеродермией, а также контрольной группы, состоящей из пациентов с синдромом Рейно, системными васкулитами, ревматоидным артритом и системной красной волчанкой.

2.  Выполнить поиск статистических взаимосвязей между клиническими особен­ностями системной склеродермии и содержанием антител к эластину и эластазе.

3.  Изучить статистическую взаимосвязь между концентрацией антител к эластину и концентрацией антител к эластазе у больных системной склеродермией и пациентов контрольной группы.

4.  Оценить эффективность использования антител к эластину и эластазе для дифференцирования системной склеродермии от других аутоиммунных ревматических заболеваний.

Научная новизна

Впервые для диагностики ССД созданы и применены в варианте иммуноферментного метода анализа иммобилизированные препараты эластина и эластазы, подобраны оптимальные концентрации антигенов и определены условия проведения ИФА с использованием ИГАП.

Показано, что уровень антител к эластину и эластазе достоверно отличается от содержания данных антител в сыворотках крови здоровых лиц и лиц контрольной группы. Выявлена корреляция между уровнем антител к эластину и эластазе и степенью активности и характером течения ССД. Установлено, что максимальные значения исследуемых антител наблюдаются при поражении суставов, легких и сердечно-сосудистой системы.

Практическая ценность

Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к эластину и эластазе на основе иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами. Показано, что выявление антител к эластину и эластазе в предложенной методике ИФА может быть использовано в качестве дополнительного теста для диагностики и дифференциальной диагностики системной склеродермии, оценки активности и прогнозирования клинического варианта заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

На защиту выносится положение о возможности определения антител к эластину и эластазе с помощью методов иммуноферментного анализа на основе иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами у больных ССД. Исследование антител к эластину и эластазе может быть использовано в качестве дополнительного теста для диагностики и дифференциальной диагностики системной склеродермии, оценки активности и прогнозирования клинического варианта заболевания.

Публикации

Основные положения диссертации изложены в 11 печатных работах, из которых 6 – в местной печати и 5 – в центральной, в том числе 4 – в изданиях, рецензируемых ВАК. Материалы диссертации были представлены на ежегодной научной конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и Клинической медицины» ВолГМУ (2009–2011гг.); конференции «Актуальные проблемы современной кардиологии и терапии» – Киров, 2009 г.

Первичная экспертиза диссертации была проведена на совместном заседании Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной ревматологии» Российской академии медицинских наук и кафедры госпитальной терапии ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ.

Внедрение в практику

Методы определения антител к эластину и эластазе с использованием иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрены в практику работы ГУЗ ГКБ №25 г. Волгограда.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, содержащих обзор литературы, клиническую характеристику исследуемых групп, методы исследования, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы и практические рекомендации. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами и 10 рисунками, приведено 2 выписки из историй болезни. Указатель литературы содержит 239 источников, в том числе 111 – отечественных и 128 – зарубежных.

Методы исследования

Исследование проводили в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Международной медицинской ассоциации, принятой в 1996 году, и рекомендациями по этике биомедицинских исследований. Соблюдение требований биоэтики подтверждено результатами экспертизы Регионального этического комитета.

Для выполнения поставленных задач были сформированы группа больных с верифицированным диагнозом ССД, а также контрольная группа. В состав последней были включены пациенты с ревматическими заболеваниями, наиболее часто вызывающими затруднения при дифференциальной диагностике с ССД.

Для установления нормальных характеристик изучаемых лабораторных показателей использовали референтную группу, состоящую из 30 практически здоровых лиц – доноров Волгоградской областной станции переливания крови (19 женщин и 11 мужчин в возрасте от 22 до 50 лет), прошедших тщательное медицинское обследование.

В качестве антигенов были использованы коммерческие препараты компании «SIGMA-ALDRICH» (США): препарат эластазы панкреатической из панкреатической железы свиньи (Elastase pancreatic from porcine pancreas, Сat. № Е1250) и препарат эластина из легкого человека (Elastin from human lung, Cat. № Е7152).

Антитела к эластину и эластазе определялись твердофазным иммуноферментным методом с использованием иммобилизированных гранулированных препаратов (ИГАП). Иммобилизацию производили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля [, , 2001]. Результаты учитывали на ИФА-ридере Multiskan EX (Thermo Electron Corporation, Шанхай, КНР) при длине волны 450 нм. Полученные значения выражали в условных единицах оптической плотности (е. о.п.), которые вычисляли как разность между средним значением оптических плотностей исследуемого образца и средним значением фона.

В ходе измерения использовали найденные нами оптимальные уровни концентрации иммобилизированных эластина (1,5 мкг/мл), эластазы (2,5 мкг/мл) и рабочего разведения сыворотки (1:200).

Результаты статистической обработки представляли в форме: «среднее арифметическое ± среднее квадратическое отклонение» (М±σ) либо среднее арифметическое (95% доверительный интервал) (М (95% Ди)).

Количественную оценку эффективности диагностического теста производили путем анализа четырехпольной таблицы и вычисления общепринятых операционных характеристик – чувствительности, специфич­ности, отношения правдоподобия положительного и отрицательного результатов [ 2006, 1998]. Перечисленные показатели были представлены в виде значений.

Поиск оптимальных точек разделения между исследуемыми группами осуществляли с помощью непараметрического варианта ROC-анализа с помощью программы SPSS 12.0 for Windows. При нахождении границы между положительными и отрицательными результатами измерения концентрации антител к эластину и эластазе принимали во внимание необходимость преимущественного исключения ошибок I типа. Напротив, при установлении точки разделения между больными ССД и контрольной группой руководствовались необходимостью минимизации ошибок как I, так и II типа. Эффективность дифференцирования ССД от контрольной группы проверяли раздельно для положительных и отрицательных результатов с помощью отношений правдоподобия положительного (LRP) и отрицательного результата (LRN), учитывая зависимость этих показателей от значения точки разделения.

Общую точность отдельного диагностического теста оценивали с помощью площади под непараметрической характеристической кривой (AUC). Достоверность отличия данного показателя от 50% (абсолютной неинформативности) и от 100% (референтного стандарта) определяли с помощью 95% доверительного интервала. Различие между точностями двух диагностических исследований тестировали посредством сравнения их AUC с помощью z-статистики [N. A. Obuchowski,2005].

В случае превышения точки разделения 0,104 е. о.п. для антител к эластину и 0,113 е. о.п. для антител к эластазе значения оптической плотности считали отражающими концентрацию изучаемых антител, в противном случае результат считали отрицательным.

Клиническая характеристика исследуемых групп

Под наблюдением находились 42 больных ССД (11 мужчин и 31 жен­щина в возрасте от 22 до 72 лет) и 40 больных другими ревматическими заболеваниями: системной красной волчанкой (10), ревматоидным артритом (22), синдромом Рейно (3), системными васкулитами (10).

Среди больных ССД инвалидность по основному заболеванию имели 24 человека (57,1%), из них III группу инвалидности - 15 человек (35,7% от общего числа больных), II группу – 9 человек (21,4%). Причем, преобладали лица наиболее социально-активного возраста (58,3% в возрасте до 55 лет).

Диффузная форма ССД была диагностирована у 18 пациентов (42,9%), лимитированная – у,1%).

Минимальная активность заболевания выявлена у 16 человек (38,1%), умеренная – у,4 %), высокая – у 4 (9,5%) пациентов.

При оценке течения ССД по классификации Н. Г Гусевой были получе-ны следующие результаты: у 2 пациентов (4,8%) имело место острое (быстро прогрессирующее) течение ССД, у,7%) – подострое (умеренно про-гресссирующее) и у,5%) – хроническое (медленно прогрессирующее) течение.

Медиана продолжительности болезни в наблюдаемой группе составила 9,2±7,4 лет (диапазон от 2 до 27 лет). 7 пациентов (16,7%) имели стаж заболевания менее 5 лет,,8%) – лет,,6%) –лет, 8 (19,1%) –лет, 5 (11,9%) более 20 лет.

Оценка этапа и динамики болезни проводилась с выделением стадии ССД по (2007 г.). В результате у 5 пациентов (11,9%) была диагностирована начальная стадия (I) с преимущественным поражением опорно-двигательного аппарата и синдромом Рейно, у,1%) – стадия генерализации (II) с характерным комплексом периферических и вис­церальных проявлений и у 8 (19,1%) – поздняя (терминальная) стадия с явлениями полиорганной недостаточности и далеко зашедшими фиброзно-склеротическими, дистрофическими и сосудисто-некротическими изменениями.

Выделение клинического варианта ССД включало детальную характе­ристику кожного синдрома, сосудистых проявлений, поражения опорно-двигательного аппарата. Анализ висцеральной патологии проводился отдельно для каждой системы на основании критериев Medsger Т. (1999г.) в модификации , (2006г.).

Изменения кожи, являющиеся ведущим диагностическим признаком заболевания, имели место у всех больных. У 27 человек (64,3%) выявлялась стадия плотного отека, у,8%) – индурации, у 1 (2,4%) – стадия атрофии. Поражение слизистых оболочек в виде атрофического и субатрофического ринита, фарингита выявлялось у,8%) пациентов.

Вторым по распространенности проявлением ССД в исследуемой группе был синдром Рейно (95,2% пациентов). Дигитальные ишемические нарушения имели место у 5 больных (11,9%).

Суставно-мышечные изменения были представлены артритами и/или теносиновитами – 42,8%, миалгиями и мышечной слабостью – 33,3%. Кальцииноз мягких тканей был диагностирован рентгенологически у 3 пациентов.

Поражение легких было самым распространенным висцеральным проявлением в группе больных ССД и включало в себя базальный пневмо­фиброз –,6%), легочную гипертензию –,2%) и адгезивный плеврит – 7 (16,7%). Среди пациентов с длительностью заболевания более 10 лет процент легочной патологии достигал 96%.

При рентгенологическом и/или эндоскопическом обследовании патоло­гия ЖКТ (эзофагит, гастродуоденит, гипотония пищевода и кишечника, грыжа пищеводного отверстия диафрагмы) в различных сочетаниях выяв-лялась у,1%) больных.

Кардиологический диагноз был сформулирован у 20 больных (47,6%) и представлял собой ишемическую болезнь сердца, некоронарогенный кардио­склероз и перикардит. Патология сердечно-сосудистой системы при ССД диагностировалась путем сбора жалоб, предъявляемых пациентом, анамнеза, а также дополнительных методов обследования, обязательными из которых были ЭКГ и ЭхоКГ. Среди ЭКГ-признаков наиболее часто выявлялись нару­шения ритма и проводимости. ЭхоКГ-признаки включали в себя гипертро­фию левого желудочка, кальциноз фиброзного кольца аортального клапана, фиброз створок аортального и митрального клапанов, систолическую и диас-толическую дисфункцию левого желудочка, расслоение листков перикарда.

Поражение почек наблюдалось у 6 больных и проявлялось в основном умеренной лабораторной и клинической симптоматикой, соответствующие I степени тяжести почечной патологии (4 пациента). Более тяжелые нарушения (креатинин ≥ 180 мкмоль/л) – диагностированы у 2 больных.

Синдром Шегрена выявлялся у 7,1% пациентов опытной группы.

Практически половина из обследованных больных ССД – 20 человек (47,6%) – принимали ГКС системного действия. Цитостатические препараты в качестве монотерапии и в дополнение к ГКС принимали 14,3% больных. Антифиброзная терапия была назначена 15 больным (35,7%). В качестве пато-генетических и симптоматических средств использовали НПВС, блокаторы кальциевых каналов и ингибиторы АПФ, дезагреганты, ангиопротекторы, метаболиты, диуретики, блокаторы протоновой помпы и средства, улучшаю­щие моторику ЖКТ. В систему комплексного лечения больных ССД вклю­чали также лечебную физкультуру, массаж и физиотерапевтическое лечение.

Медиана продолжительности госпитализации составила 32 дня (диапазон от 15 до 59 дней).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Содержание антител к эластину

При исследовании крови лиц референтной группы на наличие антител к эластину распределение оптической плотности соответствовало нормальному типу. Среднее значение оптической плотности составило для группы 0,039 ± 0,063 е. о.п. Верхняя граница нормальных значений, рассчитанная как М+3σ, составила 0,131 е. о.п. Частота выявления антител для группы в целом – 17,5%. Среднее значение антител к эластину у лиц контрольной группы составило 0,083±0,042е. о.п., 95% ДИ: 0,070-0,094 е. о.п. Статистически значимых изменений в зависимости от пола и возраста выявлено не было.

Антитела к эластину были выявлены у,1%) больных основной группы, составляя в среднем 0,125±0,068 е. о.п., 95% ДИ – 0,116-0,134 е. о.п. Отмечены статистически значимые различия между исследуемыми показателями при ССД и в группе контроля (р=0,040).

Таблица 1. Взаимосвязь между активностью ССД и уровнем

антител к эластину

Нами была проанализирована взаимосвязь между уровнем антител к эластину и активностью ССД на различных этапах лечения. Как видно из приведенных в таблице 1 данных, повышение уровня антител к эластину выявлено у 31,3% больных ССД с I степенью активности патологического процесса, 36,4% со II степенью активности и у 75,0% с максимальной степенью активности заболевания. При анализе значений исследуемых антител были выявлены статистически значимые различия между группами больных ССД с разной степенью активности заболевания (р=0,022), при этом отмечалось повышение уровня антител по мере ее возрастания.

Динамика изучаемых показателей в процессе лечения показала достоверно меньшее значение уровня антител к эластину при III степени активности ССД по сравнению с прочими пациентами (р=0,031). В остальных группах наметилась тенденция к нормализации уровня исследуемых антител, но различия между показателями до и после лечения были недостоверны.

Как видно из таблицы 2, повышение уровня антител к эластину наблюдалось у 100% больных с острым течением заболевания, 46,7% – с подострым течением и 28,0% – с хроническим. Средняя концентрация антител к эластину в группах с различным течением ССД достоверно выше, чем в контрольной группе (р<0,001), и разница между показателями антител к эластину Уровень антител к эластину в группах с хроническим и подострым течением, как в начале лечения, так и перед выпиской из стационара колебался в небольших пределах с тенденцией к снижению, что не обусловило достоверных различий. В группе с острым (быстро прогрессирующим) течением разница показателей в указанные периоды была статистически значима (р=0,028), но и после лечения уровень антител выше, чем в группе контроля.

Таблица 2. Взаимосвязь между характером течения ССД и уровнем антител к эластину

Проведен анализ взаимосвязи между встречаемостью того или иного клинического признака у больных ССД с наличием антител к эластину и при их отсутствии. Большинство клинических проявлений встречалось приблизи­тельно в равных соотношениях у пациентов с наличием и отсутствием анти­тел к эластину. Статистически значимые различия обнаружены лишь для поражения суставов и базального пневмосклероза (р<0,001).

В таблице 3 представлены описательные характеристики групп больных ССД, имеющих различные клинические признаки заболевания, с указанием уровня значимости различия с группой больных ССД без соответствующего проявления.

Таблица 3. Уровень антител к эластину в зависимости от наличия клинико-иммунологических проявлений у больных ССД

Так как эластические волокна в большом количестве содержатся в связках и легочной ткани, аутоиммунный процесс, затрагивающий эластин, проявляется соответствующей симптоматикой. Включение аутоиммунных механизмов с индукцией синтеза антител к эластину, вероятно, является одним из факторов развития воспалительных изменений в связках и синовии. Характерно, что из пациентов опытной группы, положительных по антителам к эластину, большинство имели не просто артралгии, а тендиниты и стойкие синовиты. Очевидно, что при отсутствии адекватной терапии, возникшие вследствие аутоиммунизации, нарушения обмена эластина стимулируют антителообразование к нему, создавая ″порочный круг″.

Отличительными признаками склеродермического процесса в легких являются воспалительный процесс в альвеолах, утолщение мембраны и/или структурные изменения микроциркуляторного русла, приводящие к развитию интерстициального заболевания легких или легочной артериальной гипертензии. Временная и причинно-следственная взаимосвязь факторов, участвующих в интерстициальном фиброзе до конца не ясна. Анализируя полученные в нашем исследовании результаты, можно предположить участие антител к эластину в процессах ремоделирования легочной паренхимы. По-видимому, в развитие интерстициального заболевания легких при ССД определенный вклад вносят процессы дезорганизации и деградации эластина, приводящие к снижению эластичности легочного каркаса и усугублению процессов фиброзообразования.

Интерстициальное заболевание легких является частым осложнением ССД, приводящим к снижению качества жизни, что делает особенно акту­альной диагностику раннего вовлечения легких в патологический процесс. Известно, что рентгенография легких в начальной стадии фиброзирующего альвеолита бывает недостаточно информативна и обладает низкой чувстви­тельностью. Разработка новых, высокочувствительных маркеров легочного ремоделирования, выявляемых на ранних стадиях ССД, является актуальным направлением научных изысканий. В связи с этим, механизм участия антител к эластину в развитии патологии легких при ССД требует дальнейшего изучения.

Содержание антител к эластазе

Исследование сывороток крови здоровых лиц на наличие антител к эластазе показало, что распределение оптической плотности данного показа­теля у лиц референтной группы соответствует нормальному типу. Не харак-терных для нормального распределения частот, которые могли быть обуслов­лены наличием специфических антител, выявить в данной группе не удалось.

Среднее значение оптической плотности составило для группы здоровых лиц 0,095 е. о.п., 95% ДИ 0,090-0,100 е. о.п. Верхняя граница нормальных значений, рассчитанная как М+3σ, составила 0,112 е. о.п. Среднее значение антител к эластазе у лиц контрольной группы составило 0,103±0,037е. о.п., 95% ДИ: 0,089-0,110 е. о.п.

Частота обнаружения антител к эластазе для группы в целом составила 20,0% (8 человек). Не было выявлено статистически значимых изменений изучаемого показателя в зависимости от пола и возраста.

Из 42 находившихся под нашим наблюдением больных ССД антитела к эластазе были обнаружены у 52,4% (22 человека). Среднее их значение составило 0,143±0,071 е. о.п., 95% ДИ для М – 0,138-0,159 е. о.п. Отмечены статистически значимые различия в исследуемом показателе у больных ССД по сравнению с лицами контрольной группы (р=0,038).

При сравнении групп больных ССД с различной степенью активности патологического процесса и референтной группы методом дисперсионного анализа были выявлены статистически значимые различия для антител к эластазе (р<0,001).

Концентрация антител к эластазе на различных этапах лечения и частота их выявления в зависимости от степени активности заболевания представлены в таблице 4.

Таблица 4. Взаимосвязь между активностью ССД и уровнем антител к эластазе

Повышение уровня антител к эластазе выявлено у 37,5% больных ССД с I степенью активности патологического процесса (6 человек), 59,1% со II степенью (13 человек) и у 75,0% с максимальной степенью активности (3 человека). Концентрация антител к эластазе у больных ССД при поступлении в стационар была достоверно выше уровня аналогичного показателя в контрольной группе. Статистически значимые различия (р=0,042) выявлены и между группами больных ССД с различной степенью активности заболевания. Анализ динамики антител к эластазе в процессе лечения не показал статистически достоверных изменений изучаемого показателя.

Повышение уровня антител к эластазе наблюдалось у 2 (100%) больных с острым течением заболевания, 9 (46,7%) – с подострым течением и,0%) – с хроническим. При анализе количественных показателей выявлено, что средняя концентрация антител к эластазе в каждой из групп превышает рассчитанную границу нормы, а также средние значения АТ к эластазе в группе контроля. Разница между уровнем исследуемых антител в группах с различным течением ССД была статистически достоверной.

В процессе лечения наблюдалась тенденция к снижению уровня анти-тел к эластазе в группах с хроническим и подострым течением, но динамика показателей не была статистически достоверной. В группе с острым (быстро прогрессирующим) течением разница показателей изучаемых антител до и после лечения была статистически значимой (р=0,041).

Анализ частоты и концентрации антител к эластазе у больных ССД в зависимости от стадии и продолжительности заболевания был проведен с целью изучения возможных патогенетических механизмов прогрессирования фиброзообразования и микроциркуляторных нарушений.

Результаты о содержании антител к эластазе в зависимости от стадии склеродермического процесса и продолжительности болезни представлены в таблице 5.

Приведенные данные не демонстрируют достоверных отличий между изучаемыми показателями на разных стадиях ССД, однако следует отметить, что в группе больных с начальной стадией заболевания выявлен достаточно высокий процент пациентов, позитивных по антителам к эластазе (60%). Схожий результат получен в подгруппе ССД с продолжительностью заболе­вания менее 5 лет. Ввиду малой численности данных подгрупп преобладание не было достоверным, хотя подобная закономерность делает перспективным дальнейшее исследование антителообразования к эластазе, как возможного иммунологического маркера ранней ССД.

При анализе статистической взаимосвязи продолжительности болезни и возраста дебюта заболевания с наличием антител к эластазе у больных ССД достоверной корреляции обнаружить не удалось (р=0,035) .

Таблица 5. Взаимосвязь стадии ССД и уровня антител к эластазе

Частота выявления и уровень антител к эластазе были пранализированы также в зависимости от формы ССД и наличия или отсутствия того или иного клинико-лабораторного синдрома. У больных ССД была показана статисти­чески значимая взаимосвязь между наличием поражения ЖКТ и распростра­ненностью антител к эластазе (р=0,044). С иными вариантами поражения органов достоверной ассоциации найдено не было.

Большинство клинических проявлений встречалось в относительно равных соотношениях у пациентов с наличием антител к эластазе и отрицательных по данному признаку. Статистически значимое различие с негативной по антителам к эластазе группой больных ССД было отмечено лишь при наличии поражения сердца (р<0,001).

Анализ уровня изучаемых антител в зависимости от наличия поражения того или иного органа (системы) показал, что достоверное их повышение наблюдается во всех рассматриваемых группах, превышая медиану значений исследуемого показателя в контрольной группе (р<0,001).

Наиболее высокие уровни исследуемых антител, статистически досто­верно превосходящие данные показатели в группах с другими клинико-лабораторными признаками, отмечались у пациентов с сердечно-сосудистой патологией (р<0,01).

Аутоиммунное воспаление при системных ревматических заболеваниях в настоящее время рассматривается как один из факторов риска развития раннего атеросклероза и связанных с ним кардиоваскулярных осложнений. Взаимосвязь между аутоиммунным воспалением и атеросклеротическим поражением сосудистой стенки при ССД до конца не ясна. Среди возможных механизмов иммунного атеросклероза называют прямое проатерогенное действие антител, стимуляцию ими синтеза молекул адгезии и цитокинов, захват окисленных ЛПНП, индукцию каскада сериновых протеиназ коагуля­ционной системы. Широкая субстратная специфичность нейтрофильной эластазы предполагает ее участие в указанных процессах, а антителообразо­вание к ней, вероятно, является одним из стимулирующих факторов развития сосудистого воспаления и гиперкоагуляции.

Согласно литературным данным, у 50-60% пациентов ССД помимо поражения микроциркуляторного русла, наблюдается патология сосудов среднего калибра. Среди наблюдавшихся нами больных, позитивных по анти­телам к эластазе, основными клиническими проявлениями были ИБС и атеро-склероз аорты. Это свидетельствует не только о комбинации различных механизмов в развитии аутоиммунных васкулопатий – эндотелиальной дис­функции, повышенного тромбообразования и раннего атерогенеза, но и об определенной роли специфических аутоантител, вызывающих нарушение структуры и эластичности сосудистой стенки. Способствуя возникновению и усугублению всех выше названных механизмов, антитела к эластазе являются своеобразным предиктором развития сосудистой патологии при ССД.

Нами была произведена количественная оценка диагностической эффективности изучаемых антител при дифференцировании ССД от заболеваний, составивших контрольную группу.

Характеристическая кривая концентрации антител к эластазе ограничивала на ROC-графике площадь (AUC), равную 0,%ДИ 0,604 – 0,748); отличие AUC от 0,5 было статистически значимым (p < 0,001).

Для антител к эластину AUC составила 0,%ДИ 0,505 – 0,639), при этом р было равно 0,047.

При анализе массива значений чувствительности и специфичности с помощью ROC-анализа было выявлено, что для антител к эластину максимальное значение LRP и минимальное значение LRN наблюдались при экстинкции 0,104 е. о.п., соответствующей точке разделения отрицательных результатов. Для антител к эластазе, напротив, максимальное значение LRP отмечалось для концентрации антител 0,188 е. о.п., которая существенно превышала точку разделения отрицательных результатов.

Таким образом, весь спектр значений антител к эластину был разделен на два клинических интервала, а антител к эластазе – на три. Максимальную диагностическую ценность демонстрировал интервал концентраций антител к эластазе от 0,188 е. о.п. и выше. Такой результат теста был высокоспецифичен для ССД и существенно повышал посттестовую вероятность этого заболева­ния (LRP 11,43), однако встречался менее чем у 30% пациентов (чувствитель­ность 28,24%).

Выявление концентраций антител к эластазе менее 0,188 е. о.п. не было диагностически значимым ввиду невысокой чувствительности и значитель­ной распространенности слабоположительных результатов в контрольной группе (17,50%). Исследование антител к эластину при ССД также продемон-стрировало низкую диагностическую эффективность.

Сопоставляя значения операционных характеристик, полученные нами для антител к эластину и эластазе, и значения общепринятых лабораторных маркеров ССД – антител к центромерам и антигену Scl-70 (табл.6), можно заключить, что выявление антител к эластазе в высокой концентрации (свыше 0,188 е. о.п.) характеризуется значениями чувствительности (28,57%), специфичности (97,50%) и LRP (11,43), близкими к существующим тестам. Следовательно, определение антител к эластазе в перспективе может быть использовано для верификации диагноза ССД наравне с антицентромерными антителами и антителами к Scl-70. Тем не менее, следует изучить более широкий спектр склеродермоподобных заболеваний и состояний для более точного определения диагностической ценности антител к эластазе.

Таблица 6. Основные операционные характеристики общепринятых маркеров ССД [Reveille et al., 2003]

В настоящее время в патогенезе ССД ведущая роль отводится концепции «иммунного фиброза», поэтому иммунологическим методам придается особое значение в диагностике этого заболевания. Повышение чувствитель­ности и специфичности иммунологических методов диагностики ССД, а также совершенствование технических аспектов постановки реакций является важным методическим направлением современной ревматологии.

Для выявления антител к эластину и эластазе в сыворотках крови боль­ных ССД нами был выбран иммуноферментный метод анализа с использо­ванием гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами. Применение иммобилизированных биополимеров дает этому высокоспеции­фичному и чувствительному методу ряд неоспоримых преимуществ. Механи­ческая прочность, устойчивость сорбентов к различным физико-химическим и биологическим воздействиям, возможность их неоднократного применения после проведения регенерации позволяет добиться значительного экономического эффекта.

Таким образом, в результате проведенных исследований были разрабо­таны и применены в варианте твердофазного иммуноферментного анализа иммобилизированные гранулированные препараты с магнитными свойствами на основе эластина и эластазы. С их помощью нам удалось продемонстри­ровать определенную диагностическую ценность исследования антител к сис­теме эластин – эластаза при ССД. Обобщение и систематизация накопленных знаний об антителообразовании к биополимерам экстрацеллюлярного мат-рикса и ферментам, участвующим в их катаболизме, создает основу для разработок иммуноферментного теста на основе ИГАП, способного регистри-ровать минимальные отклонения в содержании специфических антител к большинству известных антигенов. Это, несомненно, станет подспорьем в ди-агностике и дифференциальной диагностике аутоиммунных ревматических заболеваний, и что немаловажно, прольет свет на общие механизмы их патогенеза.

Выводы

1.  Распространенность антител к эластину в сыворотке крови больных системной склеродермией (38,1%) статистически значимо превышала частоту данных антител в контрольной группе, состоявшей из пациентов с другими аутоиммунными ревматическими заболеваниями (17,5%). Концентрация сывороточных антител к эластину у больных системной склеродермией также была достоверно больше, чем в контрольной группе. У здоровых лиц антитела к эластину обнаружены не были.

2.  Антитела к эластазе в группе больных системной склеродермией обнаруживались значительно чаще, чем у пациентов контрольной группы (52,4% и 20,0%, соответственно). Концентрация антител к эластазе при системной склеродермии также была статистически значимо выше по сравнению с другими аутоиммунными ревматическими заболеваниями. У здоровых лиц антитела к эластазе обнаружены не были.

3.  При системной склеродермии наличие антител к эластину ассоциируется с поражением суставов и легочной паренхимы, а наличие антител к эластазе – с поражением сердца. В контрольной группе статистически значимых ассоциаций со спектром поражения органов выявлено не было.

4.  Выявлена статистически значимая прямая тесная корреляционная зависимость между концентрациями антител к эластину и антител к эластазе у больных системной склеродермией. В контрольной группе также имела место менее тесная статистически значимая прямая корреляция между данными показателями.

5.  Определение антител к эластазе характеризуется высокой чувствитель­ностью и специфичностью при дифференцировании системной склеро­дермии и других аутоиммунных заболеваний, включенных в состав контрольной группы. Специфичность данного исследования значительно возрастает при увеличении концентрации антител к эластазе.

Практические рекомендации

1.  Полученные иммобилизированные гранулированные антигенные препараты с магнитными свойствами на основе эластина и эластазы рекомендуется использовать для выявления антител к ним у больных ССД в разработанном варианте иммуноферментного анализа.

2.  При определении антител к эластину и эластазе иммуноферментным методом с использованием ИГАП за границы нормы следует считать: 0,104 е. о.п. – для антител к эластину, 0,113 е. о.п. – для антител к эластазе.

3.  При вынесении диагностического решения следует использовать следующие значения операционных характеристик определения антител к эластазе: чувствительность 53,38%, специфичность 80,0%, отношение правдоподобия положительного результата 2,62, отношение правдоподобия отрицательного результата 0,60.

4.  При выявлении антител к эластазе в высокой концентрации (более 0,188 единиц оптической плотности) специфичность теста увеличивается до 97,50%, отношение правдоподобия положительного результата – до 11,43.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи в научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1.  Клинико-диагностическое значение определения анти­тел к эластину и эластазе в сыворотке крови больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, системной склеродермией. / , , // Кремлевская медицина. Клинический вестник. – 2011 - №2. – С.52 – 56.

2.  Антителообразование к эластину и эластазе у больных диффузными заболеваниями соединительной ткани. / , , . . // Медицинский альманах. – 2012. - №2 (21). – С.79 – 81.

3.  Клиническое значение антител к эластину и эластазе при системной склеродермии / , , . // Клиническая фармакология и терапия. – 2012. – Т.21. - №4. – С.90-92.

4.  Аутоиммунные нарушения в системе пуринового мета-болизма у больных системной склеродермией с висцеральной пато-логией. / , , //Труды XI Международного конгресса «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» 5-8 июля 2011 г., Москва. Российский аллергологический журнал. – 2011. - № 4. - вып.1. - C 426-427.

Статьи в научных сборниках и журналах

1.  Антителообразование к системе эластин-эластаза у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой и системной склеродермией. / Н. В., Ненашева, , . // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ / под ред. Академика РАМН /. – Вып. XXVI, Волгоград, Полиграфическая компания»C.57-58.

2.  Гуморальный ответ на эластин и эластазу у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, системной склеродермией. / , , . // Материалы конф. «Актуальные проблемы современной кардиологии и терапии». – Киров, 2009. – С.119-121.

3.  Изучение антителогенеза к эластину и эластазе у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, системной склеродермией. / , , // Материалы 67-й открытой науч-практ. конф. молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины»., 22-24 апреля 2009 г. – Волгоград: Изд-во ВолГМУ. – С 123-124.

4.  Образование аутоантител к эластину и эластазе у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, системной скле­родермией. / , , . // Материалы 68-й открытой науч-практ. конф. молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины»., 13-15 сентября 2010 г. – Волгоград: Изд-во ВолГМУ. – С 128-129.

5.  Аутоиммунитет к эластину и эластазе у больных систем-ной красной волчанкой и системной склеродермией. / , , . // Актуальные проблемы совре­менной ревматологии. Сборник научных работ / под ред. Академика РАМН /. – Вып. XXVII, Волгоград, Полиграфическая компания», 2010. - C.64-65.

6.  Особенности антителогенеза к эластину и эластазе у боль­ных диффузными заболеваниями соединительной ткани в зависимости от активности воспалительного процесса. / , , . // Ак-туальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ / под ред. Академика РАМН /. – Вып. XXVIII, Волгоград, Полиграфическая компания», 2011. - C

7.  Клинико-диагностическое значение определения антител к эластину у больных системной склеродермией. / , , // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник науч­ных работ /под ред. Академика РАМН /. – Вып. XXIХ, Волгоград, Полиграфическая компания», 2012. - C. 20-22.