Рис. 21. Выявление вирусного антигена в биологических пробах от инфицированных мышей методом двухцентрового ИФА парой МКА 9Е2 и 5Н6*
1 - супернатант от инфицированных клеток Vero (положительный контроль); 2 – 10 %-й гомогенат мозговой ткани; 3 – 10 %-й гомогенат печени; 4 – 10 %-й гомогенат легкого; 5 – 10 %-й гомогенат селезенки; 6 – 10 %-й гомогенат cердца; 7 – 10 %-й гомогенат почек; 8 - цельная сыворотка крови; 9 - ростовая среда от клеток Vero (отрицательный контроль).
Таблица 13
Результаты полевого испытания ИФА тест-системы “ВектоНил-антиген”
Пробы
Количество исследованных проб
Результаты, полученные при использовании тест-системы “ВекторНил-антиген”
Положительных
Отрицательных
Суспензии из органов птиц (грачи, вороны, дрозды)
62
0
62
Суспензии из комаров родов Aedes, Culex, Anopheles
114
14
100
Cуспензии из органов мелких мышевидных грызунов
52
0
52
Суспензии из клещей H. morginatum, D. reticulatum
36
1
35
Всего
264
15
249
Примечания: для конструирования диагностической ИФА тест-системы”ВектоНил-антиген” для “захвата” антигена использовали очищенные МКА 9Е2; в качестве конъюгата применялись меченые пероксидазой хрена МКА 5Н6. Биологические образцы были собраны в очагах инфекции ЛЗН в Волгоградской области сотрудниками “ЦГ и Э в Волгоградской области”.
Применение моноклональных антител в диагностике цитомегаловирусной инфекции
Получение коллекции мышиных гибридом, продуцирующих МКА к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5, ЦМВ)
Очищенные частицы ЦМВ содержат от 30 до 40 полипептидов с молекулярной массой в диапазонекДа (S. Landolfo et al., 2003). В матриксном (тегументном) слое вириона расположены, предположительно, 25 белков (W. Gibson, 1996). В связи сэтим, провести отбор гибридом, продуцирующих МКА к белку рр65, при иммунизации животных нативным АГ, достаточно проблематично.
Для иммунизации мышей - доноров иммунных спленоцитов целенаправленно был использован рек. белок рр65, полученный в результате биосинтеза в клетках E.coli ( и др., 2005). Исследование антигенных и иммуногенных свойств рек. белка рр65 не проводили, в связи с очевидностью этих характеристик. Ранее было описано применение кроличьих ПАТ, полученных к рек. белку рр65 для выявления продуктивной ЦМВИ в тканях сердца пациентов, после операции аортокоронарного шунтирования ( и др., 2005). Кроме того, для формирования отечественной стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих АТ к ЦМВ человека, были использованы рек. белки - рр150, р52 и белок рр65 (, 2008).
В результате слияния и клонирования получены, тестированы и заложены на хранение в Банк гибридом ГНЦ ВБ “Вектор” (в жидком азоте) 11 гибридных клеточных линий, стабильно продуцирующих МКА, специфичных к рек. белку рр65.
Характеризация МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65 ЦМВ
Характеризацию АТ проводили методом ТИФА с использованием рек. белка и нативного вирусного АГ, полученного в виде лизата инфицированных клеток Vero. Определяли класс IgG, концентрацию АТ в очищенных препаратах и титры специфического взаимодействия с АГ. Результаты представлены в табл. 14. Все гибридные клетки продуцировали МКА класса IgG1,. взаимодействовали в ТИФА с рек. белком в диапазоне разведений от 1/24300 до 1/1 а с нативным вирусным белком в диапазоне от 1/1600 до 1/25600 и выявляли оба белка в ИБ. Наибольшую активность при взаимодействовии с вирусным белком рр65 в ТИФА проявляли МКА 5F10.
Таблица 14
Характеристика МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65 ЦМВ
№
п/п
Название
гибридомы
и МКА
Класс IgG
Титры МКА в ТИФА
(обратные величины)
к антигенам*
Концентрация очищенных МКА (мг/мл)
Иммуноблоттинг
с использованием
антигенов**
Рекомби-нантному
Нативному
Рекомби-нантного
Нативного
1
5F10
IgG1
1968000
25600
10,3
+
+
2
1F9/H11
IgG1
1968000
12800
8,7
+
+
3
1F9/E8
IgG1
1968000
12800
7,25
+
+
4
I/A
IgG1
218700
12800
7,0
+
+
5
I/G
IgG1
24300
3200
5,3
+
+
6
I/C5
IgG1
24300
1600
4,0
+
+
7
I/H
IgG1
24300
3200
4,7
+
+
8
I/В10
IgG1
24300
3200
6,0
+
+
9
I/D4
IgG1
24300
3200
4,5
+
+
10
II/H10
IgG1
1968000
12800
7,6
+
+
11
II/C12
IgG1
1968000
12800
8,1
+
+
Примечание: * В ТИФА для сенсибилизации планшетов использовали рек. рр65 с концентрацией 1 мкг/мл, а нативный АГ (лизат инфицированных клеток Vero) в разведении 1/20. ** В ИБ рекомбинантный и нативный белки использовали в объемах по 10 и 20 мкл на дорожку, соответственно.
Выявление вирусного белка рр65 в клетках, инфицированных цитомегаловирусом человека
Для исследований ЦМВ человека используют, главным образом, диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека, так они переживают продуктивную инфекцию с характерным для этого вируса цитопатическим эффектом – округление, увеличение размеров, многоядерность ( и др., 2005; и др., 2005). Было показано, что ЦМВ человека стимулирует клетки Vero к вступлению в фазу митоза. Инфицированные клетки Vero могут нормально завершать цикл деления, так как прирост числа клеток в этой популяции обычно не ниже уровня контрольных незараженных клеток. С помощью МКА показана экспрессия сверхраннего белка р72 ЦМВ в инфицированных клетках этого вида (, 1995).
Для оценки продуктивной ЦМВИ исследовали уровень синтеза белка рр65 в нескольких культурах клеток - L-68, Vero, RH и 293. Характерное ЦПД вируса (набухание и лизис) наблюдалось только на чувствительной культуре клеток L-68, остальные инфицированные культуры не отличались визуально от контрольных незараженных клеток. На рис. 22 приведены результаты ПААГ-ЭФ лизатов инфицированных клеток перечисленных выше культур.
Визуально белок рр65 в большом количестве присутствует во всех вирусных препаратах. Однако этот белок сложно отличить от сходного с ним по молекулярной массе бычьего сывороточного альбумина (БСА, 66 кДа), содержащегося в ростовой среде от инфицированных клеток. Отмывание клеточного монослоя при получении лизатов не обеспечивает полного избавления от этого белка. В связи с этим, далее наличие специфического АГ в лизатах оценивали методом ИБ. На рисунке 23 видно, что очищенные МКА 5F10 активно выявляют нативный вирусный белок рр65 в препаратах, полученных при инфицировании ЦМВ разных культур клеток – Vero, RH и L-68.
Растворы меркаптоэтанола и SDS, использующиеся при выполнении процедуры ЭФ могут вызывать нарушение структуры вирусных белков. Для оценки эффективности взаимодействия полученных МКА с нативными вирусными белками, выращивали инфицированную культуру клеток Vero в лунках 96-луночного культурального планшета и спустя 7 суток клетки фиксировали на поверхности планшета этанолом. Инфицированные клетки обрабатывали очищенными МКА и антивидовыми антителами, меченными пероксидазой. Окрашивание проводили с использованием субстрата на основе 3-amino-9-ethylcarbazole. Результаты иммуноцитохимического анализа приведены на рис. 24. Видно, что МКА 5F10, специфичные к рек. белку рр65, интенсивно окрашивают нативный вирусный белок рр65 в виде мелких и крупных конгламератов в персистентно инфицированных клетках Vero.
Результаты исследования в ТИФА серий двукратных разведений герпесвирусных АГ показали, что применение МКА 5F10 позволяет определять рек. белок рр65 в концентрации 2,5 нг/мл (на рис. 25). Вирусный АГ, приготовленный из лизата инфицированных клеток Vero, выявляется на порядок хуже, что пропорционально относительно небольшой доле целевого белка в общем массиве лизатных протеинов. В качестве отрицательных контролей в этих экспериментах использовали нативный ВПГ-2 ( и др., 2004), так же приготовленный из лизата инфицированных клеток Vero, и рек. белок gG вируса ВПГ-2 (, 2009), который является типоспецифическим маркером для этого вируса. Исследованные МКА не вступали в перекрестные реакции ни с тем, ни с другим контрольным образцом, что свидетельствует об их типовой специфичности.
Проведенные эксперименты показали, что полученные МКА обладают высокой специфичностью и активностью, позволяющей эффективно применять их для ранней диагностики ЦМВИ.
К сожалению, отсутствие животной модели для ВГЧ–5 (ЦМВ) не позволяют исследовать протективное или лечебное действие полученных МКА. Но получение МКА может иметь потенциальное терапевтическое значение. Так как в настоящее время нет препаратов широкого антивирусного действия, идет активное исследование препаратов и подходов к лечению ЦМВИ. На том факте, что основной белок тегумента рр65 может самостоятельно доставляться из инфицированных клеток в ядра соседних клеток (S. Schmolke et al., 1995; и др., 2006), может быть сконцентрирован подход антивирусной терапии против ЦМВИ. Есть данные о том, что рр65 оказывает негативное влияние на развитие интерферонового сигнала на начальных стадиях инфицирования после проникновения вируса в клетку, до начала синтеза остальных вирусных белков (E. Browne et al., 2003). Показан вакцинный потенциал белков ВГЧ-5, синтезированных альфавирусными репликонами, несущими гены белков IE1, gB и рр65 (E. A. Reap et al., 2007; M. R. Schleiss, 2008).
Рис. 22. Результаты электрофоретического
анализа белковых препаратов
1 – очищенный рек. белок рр65 (10 мкл);
2-5 - лизаты клеток Vero, RH, L68 и 293,
инфицированных ЦМВ (по 20 мкл на дорожку);
6 – препарат очищенных МКА 5F10 (1 мкл),
7 - белковые маркеры молекулярной массы (Bio-Rad).
Рис. 23 Результаты иммуноблоттинга белков ЦМВ в лизатах инфицированных клеток с применением
МКА 5F10, специфичных к рекомбинантному белку рр65
1,2,3 – Лизаты инфицированных ЦМВ клеток Vero, RH и L68,
соответственно (по 20 мкл на дорожку).
4 – Очищенный рек. белок рр65 (10 мкл)
(положительный контроль).
5 – Лизат клеток Vero, инфицированных вирусом простого герпеса 2 типа (отрицательный контроль).
6 - Значения молекулярной массы белковых маркеров.
МКА 5F10 использованы в разведении 1/500.
Рис. 24. Выявление белка рр65 в инфицированных клетках Vero иммуноцитохимическим окрашиванием с использованием МКА 5F10
a. Не инфицированная культура клеток Vero (отрицательный контроль).
b. Не инфицированная культура клеток Vero, обработанная МКА 5F10 (отрицательный контроль).
c. Инфицированная ЦМВ культура клеток Vero, последовательно обработанная МКА 5F10 и конъюгатом антивидовых антител с пероксидазой.
Рис. 25. Результаты ТИФА серии двукратных разведений антигенов герпесвирусов
Примечания: ВПГ-2 - вирус простого герпеса 2 типа ( и др., 2004);
рек. gG – рек. белок gG ВПГ-2 (, 2009);
МКА 5F10 использованы в концентрации 2 мкг/мл.
ВЫВОДЫ
1. Создана оригинальная панель моноклональных антител (МКА), специфичных к вирусу Марбург (штамм Рорр). Получены очищенные препараты, специфичные к внутренним структурным белкам вириона - к кофактору вирусной полимеразы (белку VPвида, к нуклеопротеину - 3 вида, к матриксному белку VP40 - 9 видов, для одного вида МКА линейные эпитопы не определяются.
2. Создана оригинальная панель МКА, специфичных к вирусу Эбола-Заир (штамм Mayinga). Получены очищенные препараты, специфичные к белку VP35 (2 вида), к нуклеопротеину (10 видов), к матриксному белку VP40 – 9 видов.
3. Показано, что рекомбинантные белки GP, VP24, NP, VP40 и VP35 филовирусов сохранили антигенную структуру, характерную для аналогичных вирусных белков, и в связи с этим, они могут быть успешно использованы для иммунодиагностики филовирусных инфекций.
4. Установлено, что использование комбинации рекомбинантных белков GP, NP, VP35 и VP40 в качестве антигена повышает чувствительность твердофазного иммуноферментного анализа по сравнению с применением в качестве антигена инактивированного очищенного вируса Марбург.
5. Показано, что полученные МКА и рекомбинантные белки NP, VP40 и VP35 могут быть успешно использованы для совершенствования иммунодиагностики заболеваний, вызываемых вирусами Марбург и Эбола.
Это позволило:
- предложить новый способ выявления белка VP40 вируса Марбург методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов неконкурирующих МКА 7D8 и 7H10.
– разработать новый способ выявления белка VP35 вируса Марбург при помощи иммуноферментного анализа на основе одного типа МКА 3F9, которые можно одновременно использовать как в качестве “захватывающих антиген”, так и в качестве “индикаторных” антител.
- создать оригинальный способ выявления нуклеопротеина вируса Эбола методом двухцентрового ИФА с использованием двух типов МКА 1В2 (мышиного происхождения) и 7В11 (крысиного происхождения).
– разработать метод выявления белка VP40 вируса Эбола на основе двухцентрового ИФА и двух типов оригинальных МКА 4А2 и 1С1.
7. Создана оригинальная панель из 15-ти очищенных препаратов МКА, специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (штамм LEIV-VLGhuman). Сконструирована лабораторная тест-система ИФА на основе двух типов МКА 9Е2 и 5Н6, для выявления антигена вируса Западного Нила. Гибридная клеточная линия 9Е2, продуцирующая одноименные высокоактивные вируснейтрализующие МКА широкой специфичности (против всех штаммов ВЗН), защищена патентом РФ № 000.
8. На основе лабораторной тест-система ИФА совместно ЗАО “Вектор-Бест” разработана и начато производство экспериментальной тест-системы “ВектоНил-антиген”. Показано ее высокая эффективность для эпидемиологического исследования циркуляции вируса Западного Нила в природных очагах этой инфекции.
9. Создана оригинальная коллекция из 11 мышиных гибридных клеточных линий, продуцирующих МКА, специфичные к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типа (цитомегаловируса человека). Показана способность МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65, высокоэффективно выявлять вирусный матриксный белок рр65 - маркер острой цитомегаловирусной инфекции человека в различных типах клеток.
Список работ, опубликованных по теме диссертационной работы
1. , , Моноклональные антитела к белкам вируса Марбург и их иммунохимическая характеризация. // Вопросы вирусологии№ 6. - С. 274-279. (Список ВАК).
2. , , , , . Сравнительное исследование антигенных и иммуногенных свойств природного и рекомбинантного белков VP35 вируса Марбург. // Вопросы вирусологии№ 5. - С. 206-213. (Список ВАК).
3. , , , Разумов антитела к вирусу Эбола: получение, характеризация и изучение перекрестной реактивности с вирусом Марбург. // Вопросы вирусологии№ 3. - С. 40-44. (Список ВАК).
4. , , Выявление противовирусной активности моноклональных антител, специфичных к белкам вируса Марбург. // Вопросы вирусологии№ 1. - С. 33-37. (Список ВАК).
5. , , Разумов антигенной структуры белка VP35 вируса Эбола. // Вопросы вирусологии№ 5. - С. 25-31. (Список ВАК).
6. , , , , А, , Нетесов изучение морфологии и антигенных свойств рекомбинантных аналогов нуклеопротеина вируса Марбург. // Молекулярная биология№ 3. - С. 1-8. (Список ВАК).
7. Sorokin A. V., Kazachinskaya E.I., Ivanova A. V., Kachko A. V., Netesov S. V., Bukreev A. A., Loktev V. B., and Razumov I. A. *. Mapping of two dominant sites of VP35 Marburg virus. // Viral Immunology. – 2002. - Vol.15. - № 3. – Р. 481-92. (Список ВАК).
8. Cheusova T., Kachko A., Kazachinskaya E., Chechenko I., Razumov I., Netesov S., Ryabchikova E. Studies of the expression of Marburg virus recombinant nucleoprotein. / Ultrastructual Microskopy. – 2002. - № 4. - С. 26-27. (Список ВАК).
9. , , , , , Нетесов антигенных детерминант на N – конце белка VP35 вируса Эбола с помощью коротких рекомбинатных фрагментов этого белка. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2003. - № 2. - С.38-41. (Список ВАК).
10. Razumov IA, Kazachinskaia EI, Ternovoi VA, Protopopova EV, Galkina IV, Gromashevskii VL, Prilipov AG, Kachko AV, Ivanova AV, L”vov DK, Loktev VB. / Neutralizing monoclonal antibodies against Russian strain of the west nile virus. // Viral Immunol. – 2005. - Vol. 18. - № 3. – P. 558-68. (Список ВАК).
11. , , Казачинская Е.И., , . Индекс авидности специфических IgG в диагностике заболеваний, вызванных вирусами Западного Нила и клещевого энцефалита. // Клиническая лабораторная диагностика№ 4 - C. 29-32. (Список ВАК).
12. Alexander Pereboev, Viktoriya Borisevich, George Tsuladzea, Mikhail Shakhmatov, Debora Hudman, Elena Kazachinskaia, Ivan Razumov, Viktor Svyatchenko, Valery Loktev and Vladimir Yamshchikov. Genetically delivered antibody protects against West Nile virus. // Antivirol Research. – 2008. – Vol. 77. - № 1. – Р. 6-13. (Список ВАК).
13. , , Локтев антитела и рекомбинантные белки филовирусов. Иммунохимические свойства и оценка возможности их использования для иммунодиагностики. // Медицинская иммунология№ 3. - Том 12. - С. 177-190. (Список ВАК).
Публикации в материалах конференций
1. I. A.Razumov, E. F. Belanov, A. A. Bukreev, E.I. Kazachinskaia & N. I. Bormotov. Properties and protective capacity of monoclonal antibodies to Marburg virus. // Xth international congress of virology, Jerusalem, IsraelAbstract Book. - PW60-45. - P. 260.
2. I. A. Razumov, E. I Kazachinskaia, E. F. Belanov, A. A. Chepurnov. Mabs to filoviruses: properties, antigenic specificity, and their utility in detecting filoviral antigens. // Russian - German colloquium on filoviruses: the modern state of problem. Koltsovo, Novosibirsk region, RussiaAbstract Book. - P. 13.
3. I. A. Razumov, E. I Kazachinskaia, E. F. Belanov, A. V. Kachko, A. V. Sorokin. Monoclonal antibodies against Filoviruses. // 6th Biological Medical Defence Conference, Munchen
4. I. A. Razumov, E. I Kazachinskaia, E. F. Belanov, A. V. Kachko, A. V. Sorokin. Monoclonal antibodies against Filoviruses: Characterization of viral and recombinant proteins. // Inauguration of the Swedish Containment Laboratories, Stocgolm
5. , , , , Сорокин моноклональных антител и рекомбинантных белков для создания новых систем для выявления вируса Марбург. // Крым, ГурзуфCборник тезисов. - С. 130.
6. , , , Разумов антитела к вирусу Эбола: свойства и использование для выявления вирусных антигенов. /. Крым, ГурзуфCборник тезисов. – С. 133.
7. , , , . Использование моноклональных антител и рекомбинантных белков для выявления вируса Марбург. // г. Пущино 2001. - Тезисы докладов. - С. 142.
8. , , , , P. Collins, // г. Пущино 2001. - Тезисы докладов. - С. 140.
9. I. A. Razumov, A. V. Sorokin, E. I. Kazachinskaia, A. V. Ivanova, A. V. Kachko, S. esov, A. A. Bukreyev, V. B. Loktev, Mapping of Two Dominant Sites of VP35 of Marburg Virus. // In “The world of microbes. XIIth International Congress of Virology, 27 July – 01 August, Paris. – 2002. - Abstract Book. - P. 460
10. I. A. Razumov, E. I. Kazachinskaia, E. V.Protopopova, I. V. Galkina*, V. L. Gromashevskii*, A. G. Prilipov*, D. K. L'vov*, and V. B. Loktev Neutralizing Monoclonal Antibodies Against European Strain of the West Nile Virus. // In Seventh International Symposium on Positive Strand RNA viruses, May 27 – June 01, 2004. - San Francisco. - Abstract Book. - P. 102
11. I. A. Razumov, E. I. Kazachinskaia, E. V.Protopopova, I. V. Galkina, V. L. Gromashevskii, A. G. Prilipov, D. K. L'vov, and V. B. Loktev, Neutralizing Monoclonal Antibodies Against European Strain of the West Nile Virus. Health Canada Science Forum, October 18-19, 2004. Ottawa, Ontario.
12. Распопин И. А., И., , Гришаев авидности вирусспецифических IgG человека при лихорадке Западного Нила. Оценка возможности использования индекса авидности IgG для диагностики. // Всероссийская научно-практическая конференция “Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке”, г. Томск, 14-15 февраля 2006 г. - Тезисы докладов. - С. 114-115.
13. Распопин И. А., И., , Гришаев теста на авидность IgG для дифференцировки заболеваний, вызванных вирусами Западного Нила и клещевого энцефалита. // Всероссийская научно-практическая конференция “Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке”, Томск, 14-15 февраля 2006 г. - Тезисы докладов. - C. 112-113
14. Распопин М. А., Гришаев Н. Г., , , , Леонова авидности специфических IgG в дифференциальной диагностике заболеваний, вызванных вирусами Западного Нила и клещевого энцефалита. // III Российская научная конференция с международным участием “Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера”, г. Новосибирск 27-29 сентября, 2006 г. - Тезисы докладов. – С. 210-211.
15. Распопин О. А., , , , Гришаев вируса Западного Нила в Волгоградской области в 2006 г. // Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии (ДЖИП) 2007. - № 11. - С. 145.
16. A. Pereboev, V. Borisevich, G. Tsuladze, M. Shakhmatov, D. Hudman, E. Kazachinskaia, I. Razumov, V. Svyatchenko, V. Yamshchikov, V. Loktev. Genetically delivered antibody protects against West Nile virus, XIV International Congress of Virology, 10-15 August 2008, Istanbul. - Abstract Book. – Р. 24-25.
17. Разумов моноклональных антител для выявления вируса Западного Нила в DAS-ELISA. // Всероссийская конференция “Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология” посвященная 80-летию 48 Центрального научно-исследовательского института Министерства обороны РФ 20 – 21 ноября 2008 г.
18. , Borisevich V., Tsuladze G., Shakhmatov M., Hudman D., , , , Локтев терапия флавивирусных инфекций на примере лихорадки Западного Нила. // Научная конференция “Медицинская геномика и протеомика”, Новосибирск, ИХБФМ СО РАН, 9-13 сентября 2009, г. Новосибирск. - Тезисы докладов. - С. 30
19. , , , Локтев антитела и рекомбинантные белки филовирусов. Иммунохимические свойства и оценка возможности их использования для иммунодиагностики. // Международная научно-практическая конференция “Современные проблемы инфекционной патологии человека”. г. Минск, 2009. - Cборник научных трудов. – С. 277-280.
20. И., Суслопаров моноклональных антител, специфичных к иммунодоминатному району рекомбинантного белка рр65 цитомегаловируса человека. // Международная научно-практическая конференция “Современные проблемы инфекционной патологии человека”. г. Минск, 2009. - Cборник научных трудов. – С. 275-277.
Патенты
1. , , , , , Нетесов плазмидная ДНК pQ_f35M, кодирующая гибридный полипептид f35M, обладающий антигенными и иммуногенными свойсвами белка VP35 вируса Марбург, способ ее получения, и штамм бактерий Esherichia coli сверхпродуцент рекомбинантного полипептида f35М. // Патент РФ № , приоритет изобретения от 01.01.2001. Опубликован 20.01.2000 в БИ № 2.
2. Алексеенко гибридных клеток животного Mus musculus L. НИИМБ-280 (9Е2) – продуцент моноклональных антител к белку Е вируса Западного Нила. // Патент РФ № 2 приоритет изобретения от 01.01.2001. Опубликован 10.12.2005 в БИ № 34.
3. , , , Локтев гибридных клеток животного Mus musculus L. 3F9 – продуцент моноклональных антител, пригодных для использования в иммуноферментной системе формата “сэндвич” для выявления белка VP35 вируса Марбург и моноклональные антитела 3F9, продуцируемые указанным штаммом гибридных клеток. // Патент РФ № 2 приоритет изобретения от 15.12.08. Опубликован 27.06.2010 в БИ № 18.
4. , , , Локтев гибридных клеток животного Mus musculus L. – продуцент моноклональных антител для выявления белка VP40 вируса Марбург (штамм Рорр) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), набор для иммуноферментной системы формата “сэндвич” для выявления матриксного белка VP40 вируса Марбург (штамм Рорр). // Патент РФ № 2 приоритет изобретения от от 15.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ № 21.
5. , , , / Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 1В2 - продуцент моноклональных антител для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты), набор для иммуноферментной системы формата “сэндвич” для выявления нуклеопротеина вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). // Патент РФ № 2 приоритет изобретения от от 16.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ № 21.
6. , , , Локтев гибридных клеток животного Mus musculus L. – продуцент моноклональных антител для выявления белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga) (варианты), моноклональное антитело, продуцируемое штаммом (варианты) и набор для иммуноферментной системы формата “сэндвич” для выявления белка VP40 вируса Эбола, субтип Заир (штамм Mainga). // Патент РФ № 2 приоритет изобретения от от 18.12.08. Опубликован 27.07.2010 в БИ № 21.
7. , Cуслопаров М. А., Локтев гибридных клеток животного Mus musculus L. 5F10 – продуцент моноклональных антител, используемых для выявления белка рр65 цитомегаловируса человека”. // Патент РФ № 2 приоритет изобретения от от 15.12.08. Опубликован 27.06.2010 в БИ № 18.
Список использованных сокращений
АГ - антиген
АТ – антитела
а. о. – аминокислотное основание
АС – антисыворотка
БОЕ – бляшкообразующие единицы
ВЭ - вирус Эбола
ВМ - вирус Марбург
ВЗН – вирус Западного Нила
ВГЧ-5 - вирус герпеса человека 5 типа (цитомегаловирус человека)
ВПГ-2 - вирус простого герпеса 2 типа
ВКЭ – вирус клещевого энцефалита
ВЦ НИИМ МО РФ – Вирусологический Центр НИИ микробиологии Министерства Обороны РФ (г. Сергиев Посад)
ГЛЭ – геморрагическая лихорадка Эбола
ГЛМ - геморрагическая лихорадка Марбург
ИФА - иммуноферментный анализ
ИБ – иммуноблоттинг
ИХКГ СО РАН – Институт Химической Кинетики и Горения Сибирского отделения Российской Академии Наук
КИФА – конкурентный ИФА
ЛЗН – лихорадка Заадного Нила
МКА - моноклональные антитела
OП – оптическая плотность
ОФД - орто-фенилендиамин
ПАТ - поликлональные антитела
ПААГ - полиакриламидный гель
ПААГ-ЭФ – электрофорез в ПААГ
рук. – руководитель
НИИ ЭМ – НИИ эпидемиологии и микробиологии (Беларусь, г. Минск);
рек. белок - рекомбинантный белок
ТИФА – твердофазный ИФА
ТСБ – трис-солевой буферный раствор
ТСБ-Т - трис-солевой буферный раствор с твином
ТМБ – тетраметилбензидин
ФГУЗ РосНИИПЧИ “Микроб” – Федеральное государственное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт “Микроб”
ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор
ФБС - фетальная бычья сыворотка
ЦМВ – цитомегаловирус
ЦМВИ – цитомегаловирусная инфекция
ЦПД – цитопатическое действие
IgG – иммуноглобулин класса G
IgM- иммуноглобулин класса М
GP – гликопротеин (основой структурный белок оболочки филовируса
NP – нуклеопротеин (основой структурный белок нуклеокапсида филовируса)
SDS – додецилсульфат натрия
RH – клетки почки эмбриона человека
L-68 – диплоидные клетки легкого эмбриона человека
Vero – клетки почки африканской зеленой мартышки
VP40 – матриксный белок филовируса
VP35 – структурный белок филовируса (кофактор вирусной полимеразы)
VP24 – белок оболочки филовируса
Благодарности
Автор выражает благодарность всем коллегам за поддержку данной работы и за сотрудничество: научному консультанту д. б.н., профессору , д. б.н. , к. б.н. , н. с. , к. б.н. , д. б.н., профессору , к. б.н. , н. с. , зав. лаб. ЗАО “Вектор-Бест” , ст. лаборанту ЗАО “Вектор-Бест” За предоставленные для исследования препараты: д. б.н. за инактивированный вирус Эбола и сыворотку крови иммунизированного кролика, к. б.н. за инактивированный вирус Марбург, к. б.н. за рекомбинантный белок VP35 вируса Эбола, к. б.н. за инактивированные препараты вирусов клещевого и японского энцефалитов, д. м.н. за нативные герпесвирусы (5 и 2 типов) и рекомбинантный белок рр65 ВГЧ-5, зав. лаб. вирусологии флавивирусов к. б.н. и с. н.с. за ценную консультативную помощь при работе с инфекционными вирусами, ведущего инженера за помощь при очистке вируса Западного Нила, ст. лаборанта за техническую помощь, ст. лаборанта за работу с животными.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
