На правах рукописи
Этиологическая значимость дрожжевых грибов рода Malassezia при кожных заболеваниях животных
16.00.03 – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Москва 2008
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ).
Научный руководитель:
Кандидат ветеринарных наук
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук
Бедоева Зелихан Михайловна;
Кандидат ветеринарных наук
Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИИТИБП).
Защита диссертации состоится «____» ______________ 2008 г. в «____» часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.01 при Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени » (ФГОУ ВПО МГАВМиБ) Москва, ; тел. (4
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ.
Автореферат разослан «___»___________________2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Инфекции, вызываемые дрожжевыми грибами, в последние годы стали одним из приоритетных вопросов ветеринарной микологии. Возрастает их распространенность среди домашних животных, выявляются новые этиологические агенты, однако вопросы диагностики, терапии и профилактики дрожжевых инфекций животных остаются недостаточно изученными.
Роль дрожжевых грибов в этиологии инфекционных заболеваний («молочницы») была впервые продемонстрирована Langenbeck в 1839 г., и впоследствии подтверждена G. Ainsworth (1986). По данным M. Chengappa (1984) дрожжевые грибы способны вызывать у животных патологии различной формы – заболевания мочеполовой системы, пищеварительного тракта (стоматиты, гастриты, энтериты), а также кожные поражения и заболевания органов слуха.
Проблема дрожжевых инфекций обострилась в последние 2 десятилетия. Возросло количество этих заболеваний, были описаны патогенные свойства у ряда видов грибов, ранее считавшихся сапротрофными (K. Hazen, 1995). В последние годы медицинскими и ветеринарными микологами пристальное внимание уделяется заболеваниям человека и животных, вызываемым дрожжевыми грибами рода Malassezia (G. Midgley, 2000; R. Batra et al., 2005; G. Guisiano, 2006). Являясь представителями нормальной микобиоты кожи теплокровных животных и человека, при определенных условиях они способны вызывать патологический процесс. У людей эти микроорганизмы участвуют в патогенезе кожных заболеваний («пестрый лишай», себорейный дерматит, фолликулиты, расстройства пигментации), а также вызывают системные микозы у лиц с ослабленным иммунным статусом. У животных роль грибов рода Malassezia в патогенезе ряда заболеваний (дерматитов, отитов, атопического дерматита и других) была установлена относительно недавно (V. Sanguenti et al., 1984, E. Cuttin et al., 1985).
На сегодняшний день окончательно не установлено, способны ли эти грибы самостоятельно вызывать заболевания, или же только на фоне предрасполагающих факторов; какие именно механизмы обеспечивают трансформацию грибов рода Malassezia из комменсальной формы в патогенную. До сих пор в ветеринарии нет общепринятых методов и критериев диагностики Malassezia-инфекций животных. В нашей стране эти заболевания целенаправленно практически не изучались, информированность о них врачей остается неудовлетворительной.
Следовательно, изучение распространенности, этиологической структуры и клинико-эпизоотологических особенностей Malassezia-инфекций животных, а также разработка и совершенствование методов лабораторной диагностики данных заболеваний является актуальной задачей для ветеринарии.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - изучение этиологической значимости грибов рода Malassezia при кожных заболеваниях мелких домашних животных, разработка рациональной схемы диагностики Malassezia-инфекций.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать оптимальный алгоритм выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных.
2. В сравнительном аспекте изучить частоту встречаемости и плотность популяции грибов рода Malassezia в слуховом канале здоровых животных и больных острыми и хроническими отитами.
3. Изучить распространенность и этиологическую структуру Malassezia-инфекций среди мелких домашних животных Московского региона.
4. Изучить клинические формы и предрасполагающие факторы Malassezia-инфекций мелких домашних животных.
5. Выделить культуры возбудителей Malassezia-инфекций животных, изучить их биологические свойства (морфологические, физиологические, вирулентные).
6. Определить оптимальные условия поддержания и хранения культур грибов рода Malassezia.
Научная новизна. Впервые разработан алгоритм выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных.
Впервые получены количественные данные об изменении частоты встречаемости и плотности популяции грибов рода Malassezia в слуховом канале здоровых животных и больных острыми и хроническими отитами, что демонстрирует роль этих микроорганизмов в патогенезе хронических отитов.
Впервые в РФ получены данные о широкой распространенности Malassezia-инфекций среди мелких домашних животных, систематизированы их клинические формы, выявлены предрасполагающие факторы.
Показано, что основным возбудителем Malassezia-инфекций мелких домашних животных в РФ является вид M. pachydermatis.
Впервые выделена чистая культура эпизоотических штаммов возбудителя, охарактеризованы их морфологические, физиологические и вирулентные свойства.
Впервые был воспроизведен экспериментальный Malassezia-дерматит при накожном заражении собак.
Практическая значимость.
Паспортизированы этиологические штаммы M. pachydermatis №№:12803, 15003, 15503, 16103, 16903 ВГНКИ, которые хранятся в отделе контроля качества и стандартизации лекарственных средств против микозов и микотоксикозов животных ФГУ ВГНКИ.
Разработан алгоритм, выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных, одобренный на межлабораторном совещании ФГУ ВГНКИ 05.07.2007 г. и рекомендован к утверждению на Федеральном уровне.
Разработан метод диагностики поверхностных микозов животных апробированный в условиях ветеринарных клиник Москвы, Казани и других городов РФ.
В опытах на лабораторных животных при экспериментальном заражении собак изучен патогенез поверхностных микозов, вызванных этиологическими штаммами M. pachydermatis, дана оценка влияния M. pachydermatis на обменные и иммунные процессы организма животных.
Разработаны и утверждены в установленном порядке методические указания по диагностике микозов животных, вызываемых грибами рода Malassezia, которые позволяют рационализировать микологический анализ кожного покрова и слухового канала животных.
Результаты исследований используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГУПБ, ФГОУ ВПО РУДН, ФГОУ ВПО УГАВМ, ФГОУ ВПО МГАВМиБ по дисциплинам: «Микробиология», «Биология и патология мелких домашних, лабораторных и экзотических животных».
Апробация результатов исследований. Материалы исследований изложены на заседаниях Учёного совета, методических комиссиях ФГУ ВГНКИ (); Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» (г. Владимир, 2004); Всероссийской конференции «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» (г. Москва, 2004); IV Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (г. Москва, 2005)
Публикации результатов исследований. Основные результаты исследований опубликованы в 7 научных работах, в т. ч. 1 статья в научном журнале, 6 – в сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 165 листах машинописного текста и включает такие разделы, как введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов исследований, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (171 источник в т. ч. 161 иностранный) и приложения. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 49 рисунками.
Основные положения и результаты работы, выносимые на защиту:
1. Результаты изучения клинической роли грибов рода Malassezia при кожных заболеваниях животных.
2. Метод лабораторной диагностики Malassezia-инфекций домашних животных.
3. Результаты изучения распространенности, этиологической структуры, клинико-эпизоотологических особенностей Malassezia-инфекций домашних животных.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследований
Работа выполнена в г на базе отдела контроля качества и стандартизации лекарственных средств против микозов и микотоксикозов животных ФГУ ВГНКИ, а также Ветеринарном Центре ФГОУ ВПО МГАВМиБ и др. ветеринарных клиниках г. Москвы. При выполнении работы было использовано 227 собак и 17 кошек различных пород и возрастных групп, принадлежавших питомникам и частным лицам. Были сформированы три группы животных: животные с клиническими проявлениями отита, животные с клиническим проявлениями дерматита, клинически здоровые животные. При изучении вирулентности культур грибов для экспериментального заражения использовано 175 белых мышей в возрасте 5 - 6 нед., массойг.
Для изучения биологических свойств было использовано 32 штамма грибов вида M. pachydermatis, выделенных от животных.
Для выделения культур грибов и изучения их свойств использовали: сусло-агар, среды Чапека, Сабуро, Барфатини, Диксона модифицированную, ПД-2,защитную среду «№ 4 ВГНКИ» и молоко с 5% инозита.
Для отбора патматериала применялись методы с использованием контактных чашек (бакпечаток), липкой ленты, ватного тампона-зонда, коллектора с транспортной средой Эймса, соскоба, смыва.
Для окрашивания препаратов применяли лактофенол синий, лактофуксин, метиленовую синь. Микроскопию проводили в световом микроскопе Micros (Австрия) при увеличении х40, х100, х200, х400.
Видовую идентификацию культур грибов проводили в соответствии с определителем «Atlas of clinical fungi» (G. S. de Hoog et al., 2000).
Изучение физиологических свойств включало определение уреазной активности при посеве культур на среду Кристенсена с мочевиной; определение ферментации цитрата при посеве на цитратную среду Кристенсена; определение каталазной активности по B. Tarazooie et al. (2004). Ассимиляцию источников липидов (Твин-40, Твин-80) изучали луночно-диффузионным методом по J. Guillot (1996).
Изучение вирулентных свойств грибов рода Malassezia проводили путем парентерального заражения белых мышей суспензиями культур с концентрацией дрожжевых клеток: 200 млн/см3, 500 млн/см3, 1 млрд/см3, 2 млрд/см3, 3 млрд/см3, 4 млрд/см3. Показатель LD50 вычисляли по методу Кербера в модификации Ашмарина.
Определение чувствительности культур грибов к антифунгальным препаратам проводили диско-диффузионным методом. Использовали диски, импрегнированные антифунгальными препаратами производства HiMedia амфотерицин-В, нистатин, клотримазол, флуконазол, кетоконазол, тербинафин.
Статистическую обработку и интерпретацию экспериментальных данных проводили биометрическими методами (Г. Лакин, 1990) с использованием пакета анализа данных программы Microsoft Excel.
В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с канд. биол. наук , которому выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Разработка алгоритма диагностики Malassezia-инфекций животных
В настоящее время в ветеринарной практике не существует единого общепринятого алгоритма выявления грибов рода Malassezia на кожном покрове и в слуховом канале животных. Для достижения искомого результата в рамках исследования предстояло: 1. Отработать оптимальный метод отбора патологического материала, пригодный для повседневного применения в ветеринарной практике и отвечающий специфическим требованиям; 2. Определить оптимальную питательную среду для выделения грибов рода Malassezia из патологического материала, метод посева и условия культивирования, с учетом физиологических особенностей возбудителя; 3. Изучить сохранность грибов рода Malassezia в образцах патматериала, отобранных различными методами; 4. Разработать оптимальную схему видовой идентификации грибов рода Malassezia.
Сравнительная оценка методов выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных
Апробация методов отбора патологического материала проводилась на 27 собаках, подозреваемых на наличие Malassezia-инфекций как в форме кожных поражений (дерматитов), так и в форме отитов. Сравнительная апробация данных методов показала, что оптимальным для повседневного использования в ветеринарной практике является метод с использованием ватного тампона-зонда (сухого или с транспортной средой). Использование тампона-зонда удобно, позволяет проводить отбор проб из труднодоступных участков тела (в т. ч. из слухового канала), а при посевах проб на питательные среды возможна количественная оценка плотности популяции дрожжевых грибов. Кроме того, использование тампонов-зондов в коллекторах, изготовляемых промышленным способом, позволяет стандартизовать процедуру отбора патологического материала, что обеспечивает воспроизводимость и сопоставимость результатов микологического анализа. С целью подбора оптимальной питательной среды для культивирования грибов рода Malassezia было проведено сравнительное изучение жизнеспособности 5 эпизоотических штаммов M. pachydermatis на различных питательных средах (табл. 1).
Табл. 1. Жизнеспособность эпизоотических штаммов M. pachydermatis на различных питательных средах
Питательная среда
№ штамма M. pachydermatis
М / σ
12803
15003
15503
16103
16903
Барфатини
млн/см3
36,0±1,7
41,0±3,3
39,0±1,3
33,0±4,7
37,0±0,7
37,7/3,03
с. ж.к. (%)
72,0±2,4
82,0±7,6
78,0±3,6
67,0±7,4
74,0±0,4
74,4
Сусло-агар
млн/см3
17,0±1,6
22,0±3,4
20,0±1,4
15,0±3,6
19,0±0,4
18,6/2,70
с. ж.к. (%)
34,0±3,2
44,0±6,8
40,0±2,8
30,0±7,2
38,0±0,8
37,2
Сабуро
млн/см3
16,0±3,4
24,0±4,6
21,0±1,6
16,0±3,4
20,0±0,6
19,4/3,43
с. ж.к. (%)
32,0±6,8
48,0±9,2
42,0±3,2
32,0±6,8
40,0±1,2
38,8
Сусло-агар + хлорамфеникол
млн/см3
9,0±2,2
14,0±2,8
13,0±1,8
8,0±3,2
12,0±0,8
11,2/2,58
с. ж.к. (%)
18,0±4,4
28,0±5,6
26,0±3,6
16,0±6,4
24,0±1,6
22,4
Диксона
млн/см3
34,0±1,6
40,0±4,4
38,0±2,4
30,0±5,6
36,0±0,4
35,6/3,84
с. ж.к. (%)
68,0±3,2
80,0±8,8
76,0±4,8
60,0±11,2
72,0±0,8
71,2
ПД-2
млн/см3
20,0±1,8
25,0±3,2
24,0±2,2
17,0±4,8 /
23,0±1,2
21,8/3,27
с. ж.к. (%)
40,0±3,6
50,0±6,4
48,0±4,4
34,0±9,6
46,0±2,4
43,6
Чапека
Роста нет
Роста нет
Роста нет
Роста нет
Роста нет
Примечание: «с. ж.к.» – содержание жизнеспособных клеток относительно общей концентрации клеток гриба; Млн./см3 – общая концентрация дрожжевых клеток; М – средняя арифметическая вариационного ряда; σ - стандартное отклонение вариационного ряда.
Как следует из данных таблицы, наибольшую жизнеспособность культур M. pachydermatis обеспечивали липид-содержащие питательные среды Барфатини и Диксона (соответственно 67,0±7,4% - 82,0±7,6% и 60,0±11,2% - 80,0±8,8% жизнеспособных клеток). Наиболее быстрое начало роста культур M. pachydermatis отмечали также на липид-содержащих средах Барфатини и Диксона – визуально рост колоний на этих средах наблюдали уже на 2-е сутки. Морфологические признаки колоний становились отчетливыми на 4-5-е сут. на липид-содержащих средах и на 6-7 сут. на средах без источников липидов.
Исходя из полученных результатов, в дальнейшем для выделения грибов рода Malassezia из патологического материала была использована среда Барфатини.
При изучении сохранности грибов рода Malassezia в образцах патматериала было установлено, что при хранении в коллекторах с транспортной средой Эймса жизнеспособность грибов оставалась стабильной в течение 7 сут. при 5-80С (рис. 1).
Рис. 1. Жизнеспособность грибов рода Malassezia в образцах патологического материала при различных условиях хранения
В образцах, хранившихся в сухих коллекторах, жизнеспособность Malassezia spp сохранялась на исходном уровне в течение первых 2 сут., однако уже на 3-е сутки количество жизнеспособных дрожжевых клеток сократилось до 87,6 КОЕ, что составило 61,2% от исходного количества. На 7-е сут. из образцов было выделено лишь 16,3 КОЕ грибов (11,3%).
Таким образом, для отбора патматериала целесообразно использовать коллекторы с транспортной средой Эймса, обеспечивающие сохранность Malassezia spp. в образцах в течение минимум 7 сут. При отсутствии коллекторов с транспортной средой, тампоны-зонды можно хранить в сухих коллекторах, но в этом случае культуральный анализ необходимо провести в течение 2 сут. после отбора образцов патматериала.
Рис. 2. Алгоритм выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных
В результате проведенных исследований был разработан алгоритм выявления грибов рода Malassezia в организме животных, этапы которого представлены на рисунке 2. Данный алгоритм был использован для дальнейшего изучения этиологии, распространенности и клинико-эпизоотологических особенностей Malassezia-инфекций животных.
Изучение частоты встречаемости и плотности популяции грибов рода Malassezia в слуховом канале клинически здоровых животных и животных с клиническими проявлениями отита.
В силу того, что грибы рода Malassezia являются частью нормальной микобиоты кожи многих теплокровных животных, стояла задача установить, насколько изменяется встречаемость и плотность популяции Malassezia spp. у здоровых животных и животных с проявлениями отитов (острых и хронических).
Был проведен микологический анализ материала из слухового канала 27 клинически здоровых собак и 26 собак с проявлениями отита, в т. ч. 17 собак с хроническим течением отита и 9 с острым. Результаты исследования представлены на рис. 3.
Рис. 3. Частота выделения и плотность популяции грибов рода Malassezia в слуховом канале клинически здоровых собак и собак с признаками острых и хронических отитов
Встречаемость грибов рода Malassezia в слуховом канале здоровых собак составила 29,6%, при этом выделяли лишь единичные колонии (плотность популяции в среднем 7,0 КОЕ). От 17 собак с проявлениями хронического отита грибы рода Malassezia были выделены в 88,2% случаев, при этом плотность популяции гриба составила в среднем 213,4 КОЕ. В то же время у собак с острым течением отита грибы были изолированы в 55,5% случаев, однако плотность популяции была незначительной (в среднем 6,2 КОЕ).
Можно заключить, что существует выраженная корреляция между патологическим процессом (хроническим отитом) и многократным увеличением плотности популяции грибов рода Malassezia в очаге поражения, что указывает на этиологическую роль грибов при данной патологии. При острых отитах напротив не наблюдали увеличение плотности популяции дрожжей в слуховом канале, что не позволяет сделать вывод об этиологической роли Malassezia spp. в данном случае.
Изучение клинико-эпизоотологических особенностей Malassezia-инфекций животных в Московском регионе
Было проведено обследование 187 животных, в т. ч. 170 собак и 17 кошек различных пород. У собак в 143 случаях имелись клинические проявления отитов, в 27 случаях – кожные поражения (дерматиты). Все обследованные кошки имели клинические проявления отитов. Результаты микологического анализа патматериала от собак с клиническими проявлениями отита представлены на рис. 4.
Рис. 4. Видовой состав микроорганизмов, изолированных от собак с клиническими проявлениями отита
Гриб M. pachydermatis изолирован из 115 изученных проб (80,4%). В большинстве случаев (52,4%) выделяли только M. pachydermatis, в 25,2% этот вид выделяли в ассоциации с бактериальной микрофлорой. В 2,8% M. pachydermatis выделяли в ассоциации с мицелиальными недерматофитными грибами (НДГ). Реже всего (2,0%) из слухового канала выделяли только НДГ. Из 2,8% проб микроорганизмы не были изолированы.
Полученные данные свидетельствуют о доминирующей роли M. pachydermatis в этиологии отитов у собак, как в качестве единственного возбудителя, так и в ассоциации с другими микроорганизмами, прежде всего бактериями. Результаты изучения этиологии дерматитов у собак представлены на рис. 5.
Рис. 5. Видовой состав микроорганизмов, изолированных от собак с клиническими проявлениями дерматитов
Наиболее часто (40,7%) из кожных поражений собак выделяли недерматофитные грибы (НДГ), бактерии (25,9%), а гриб M. pachydermatis выделены только в 14,8% случаев, что сопоставимо с встречаемостью грибов-дерматофитов (11,1%). От 17 кошек с проявлениями отита M. pachydermatis выделен в 11,8% случаев. Более существенную роль в этиологии отитов у кошек играли бактерии и ушные клещи (29,4% и 17,6%). В 41,2% случаев этиология заболевания очевидно носила неинфекционный характер.
M. pachydermatis был единственным видом рода Malassezia, выделенным от животных в наших исследованиях.
Выявление наиболее характерных клинических особенностей (клинических предикторов) Malassezia-инфекций животных
Было проведено изучение локализации, клинических проявлений, длительности заболевания. В большинстве случаев (63,5%) при Malassezia-отитах у животных наблюдались двухсторонние отиты. Односторонняя локализация наблюдалась в 22,6% случаев, а в 13,9% при односторонних отитах при дальнейших клинических наблюдениях отмечали распространение патологического процесса на второе ухо.
На основании характера ушного экссудата было диагностировано несколько форм Malassezia-отитов у собак, а именно гнойная форма, характеризовавшаяся выделением гнойного экссудата сметанообразной консистенции, (диагностирована у 6,1% больных животных); церуминозная форма, при которой образовывался обильный ушной секрет различного цвета и консистенции, (диагностирована у 85,2% больных животных); себорейная форма, характеризовавшаяся образованием множественных сухих бляшек и корочек на медиальной стороне пораженной ушной раковины, (диагностирована у 8,7% больных животных).
Среди других клинических признаков наиболее часто встречались гиперемия, зуд, болезненность. В силу зуда часто наблюдали самотравмирование животных – расчесы в области ушных раковин, а в отдельных случаях – образование гематом. Также наблюдали гиперкератоз, лихенизацию кожи ушных раковин и устья слухового канала – признаки, характерные для хронических воспалительных процессов. Всегда поражения сопровождались специфическим неприятным запахом.
Во всех зарегистрированных случаях течение Malassezia-отитов было хроническим, длительность заболевания составляла не менее 3-6 мес. и достигала 3 и более лет. В большинстве случаев (75%) владельцы животных обращались за ветеринарной помощью, когда клинические признаки отита наблюдались уже в течение 1-3 лет. Самый длительный срок заболевания, зарегистрированный в данном исследовании – 5 лет и 3 месяца. Как правило, заболевание носило персистирующий характер, с периодическими улучшениями и обострениями.
При Malassezia-дерматитах у собак кожные поражения были локализованы на вентральной поверхности тела в области паха, брюшины (25%), на морде в области губ (25%), в межпальцевых пространствах (50%). Клинически поражения характеризовались ярко-выраженной эритемой, сальным жироподобным экссудатом, мацерацией кожи, образованием пустул. Поражения кожи поверхности тела распространялись на значительную площадь, характеризовались гиперкератозом, лихенизацией, гиперпигментацией и образованием комедонов. Поражения сопровождались зудом, особенно сильным при локализации в межпальцевых пространствах – в этих случаях животные интенсивно вылизывали и покусывали пораженные участки. Течение заболевания также было хроническим.
Изучение эпизоотологических особенностей Malassezia-отитов у собак
Установлено, что Malassezia-отитами чаще болеют самки (60,9%), нежели самцы (39,1%). Заболевание регистрировалось у собак практически любого возраста, но наиболее часто у животных старше 6 лет (40,0%). Среди пород с диагнозом Malassezia-отит большинство относилось к брахицефалам – породам с укороченной мордой - шарпей (13,7%), чау-чау (10,5%), английский и французский бульдоги (7,3 и 5,5%), а также к породам с длинными висячими ушными раковинами - бассет-хаунд (18,5%), коккер-спаниель (8,0%).
Установлено, что частота выявления Malassezia-отитов была выше в весенний (28,7%) и осенний (39,1%) периоды, нежели в зимний и летний, что может быть связано с обострениями хронических инфекционных процессов.
В большинстве случаев (63%) Malassezia-инфекции были ассоциированы с пищевыми аллергиями, в 53% - с иммунопатиями (атопический дерматит и др.), в 42% - с эндокринными заболеваниями (гипотироидизм, гиперадренокортицизм). Реже в истории болезни фигурировали инфекционные заболевания, травмы, новообразования, гепатопатии. 42% животных подвергалось лечению гормональными препаратами, 25% получало антибиотики. Только у 17% животных не были выявлены какие-либо сопутствующие патологии.
Таким образом, большинство случаев Malassezia-отитов развивалось на фоне какой-либо первичной патологии. Применение антибиотиков и гормональных препаратов также часто коррелировало с возникновением Malassezia-отитов.
Изучение биологических свойств эпизоотических штаммов M. pachydermatis
В процессе исследования от животных было изолировано, выделено в чистую культуру и идентифицировано 115 штаммов грибов вида M. pachydermatis, у 32 из которых были изучены морфологические, цитоморфологические, физиологические свойства, у 5 также и вирулентные.
Тканевая форма M. pachydermatis представлена овальными дрожжевыми клетками с толстой оболочкой, напоминающими по форме «отпечаток стопы». Клетки в основном почкующиеся, почкование монополярное, перкуррентное. Клетки располагаются одиночно или в скоплениях. Псевдомицелий не обнаружен.
На среде Барфатини (7 сут. роста) M. pachydermatis образует округлые колонии, светло-желтые или светло-кремовые, слегка выпуклые, морщинистые, матовые. Края неровные, слабо-фестончатые. Вокруг колоний заметна зона помутнения среды шириной 2-3 мм. Реверс желтый. Диаметр колоний 3-5 мм (см. рис. 6а).
Морфологические свойства M. pachydermatis на средах Сабуро, сусло-агаре и сусло-агаре с хлорамфениколом были схожи между собой: колонии округлой формы, от светло-кремового до светло-коричневого цвета, выпуклые, гладкие, матовые. Края ровные. Реверс бесцветный, диаметр 3-5 мм. Диаметр колонии гриба на среде с антибиотиком был несколько ниже – 2-3 мм.
При микроскопии M. pachydermatis наблюдали клетки овальной, эллиптической формы, с толстой оболочкой. Почкование бластоконидиального типа, монополярное, перкуррентное. Почкующиеся клетки по форме напоминают «отпечаток стопы». Дочерние клетки в основном такой же ширины, как и материнские. Псевдомицелий не обнаружен. Размер клеток 3,0-6,5 х 2,5 мкм.
При изучении ферментативных, ассимилятивных свойств и термотолерантности 32 эпизоотических штаммов M. pachydermatis установлено, что все они были способны к росту на среде Сабуро без липидов, ассимилировали Твин-40 и Твин-80. Также все штаммы проявили способность к росту при 400С, а у некоторых из них энергия роста при 400С была выше, нежели при 360С. Штаммы ферментировали мочевину и цитрат, проявляли каталазную активность.
По степени чувствительности к антифунгальным препаратам штаммы гриба M. pachydermatis отличались между собой. К нистатину было чувствительно наибольшее количество изученных штаммов (47,3%), к тербинафину – 42,1%. Наименьшую активность проявил амфотерицин В – он ингибировал только 16,7% штаммов M. pachydermatis. Клотримазол и флюконазол ингибировали соответственно 27,4% и 24,2% изученных штаммов.
Для изучения вирулентности 5 эпизоотических штаммов M. pachydermatis было проведено внутрибрюшинное заражение белых мышей с последующим расчетом LD50. Результаты опыта представлены в табл. 2
Табл. 2. Определение LD50 эпизоотических штаммов M. рachydermatis
№ штамма
Источник
происхож-дения
Показатель
Заражающая доза, млрд/см3
LD50, млрд
0,2
0,5
1
2
3
4
12803
Хр. отит у собаки
Кол-во животных
5
5
5
5
5
5
1,62
Из них пало
-
-
-
-
1
4
Выделена субкультура
н/о
н/о
н/о
н/о
+
+
15003
Дерматит у собаки
Кол-во животных
5
5
5
5
5
5
1,41
Из них пало
-
-
-
1
2
2
Выделена субкультура
н/о
н/о
н/о
+
+
+
15503
Слуховой канал здоровой собаки
Кол-во животных
5
5
5
5
5
5
2,10
Из них пало
-
-
-
-
1
2
Выделена субкультура
н/о
н/о
н/о
н/о
+
+
16103
Хр. отит у собаки
Кол-во животных
5
5
5
5
5
5
2,45
Из них пало
-
-
-
-
-
2
Выделена субкультура
н/о
н/о
н/о
н/о
н/о
+
16903
Хр. отит у собаки
Кол-во животных
5
5
5
5
5
5
1,86
Из них пало
-
-
-
1
2
4
Выделена субкультура
н/о
н/о
н/о
+
+
+
Клинически экспериментальная инфекция у мышей проявлялась апатией, анорексией, проявлением зуда кожного покрова, появлением алопеций. Гибель животных в большинстве случаев отмечалась на 2-7 сутки после инъекции культуры. У павших животных при вскрытии иследовали патологоанатомические изменения во внутренних органах.
В результате микологического анализа от всех павших мышей выделены субкультуры штаммов M. pachydermatis, использовавшихся для экспериментального заражения. Была установлена патогенность всех пяти изученных штаммов для мышей при парентеральном введении, однако LD50 варьировала от 1,41 до 2,45 млрд. клеток/доза. При этом не было обнаружено взаимосвязи степени патогенности и источником происхождения штамма.
Для дальнейшего изучения патогенности M. pachydermatis методом накожного заражения был отобран штамм № 000, проявивший наибольшую вирулентность. Клинические признаки в местах заражения были отмечены у 2-х из 3-х зараженных собак, поражения носили характер сквамозного дерматита (образование сухих корочек, струпьев). Наибольшая интенсивность клинических признаков была отмечена на 3-е сутки, а на 6-е сут. наблюдали полное очищение очагов и рост нового волоса. Из мест заражения были выделены субкультуры штамма M. pachydermatis 15003.
Таким образом, была продемонстрирована способность M. pachydermatis вызывать экспериментальный дерматит при накожном заражении, однако патологический процесс протекал в легкой форме, и в короткие сроки разрешался полным самовыздоровлением.
Изучение условий поддержания и хранения культур M. pachydermatis
Установлено, что при поддержании культур M. pachydermatis на агаризованных питательных средах интервалы между пересевами не должны превышать 1 мес. при использовании сусло-агара, и 1,5 мес. при использовании среды Барфатини.
Хранение культур M. pachydermatis в глицерине при температуре С обеспечивало выживаемость гриба в течение 3-х мес. (срок наблюдения).
Лиофилизация с использованием защитных сред №4 ВГНКИ и молока с 5% инозитом обеспечивала сохранность культур M. pachydermatis в течение 3,5-летнего хранения, однако содержание жизнеспособных клеток снижалось с 61,0-65,0% до 2,5-5,0% (среда №4 ВГНКИ) и с 57,0-69,0 до 2,3-2,4% (молоко с 5% инозитом).
Можно заключить, что метод лиофилизации перспективен для длительного хранения M. pachydermatis, однако требует существенной оптимизации для обеспечения большей жизнеспособности гриба.
ВЫВОДЫ
1. Грибы рода Malassezia выявлены в слуховом канале у 29,6% здоровых собак и у 88,2% собак с проявлениями хронических отитов. Развитие Malassezia-инфекций обусловлено многократным увеличением плотности популяции грибов в слуховом канале по сравнению со здоровыми животными.
2. Для выделения грибов рода Malassezia из патологического материала, в т. ч. липид-зависимых видов, предотвращения контаминации посевов и облегчения видовой идентификации при лабораторной диагностике целесообразно использовать среду Барфатини и среду Сабуро с хлорамфениколом.
3. У собак с хроническим отитом этиологическая роль грибов рода Malassezia установлена в 80,4% случаев, у собак с кожными поражениями (дерматитами) – в 14,8% случаев, у кошек с отитами – в 11,8% случаев. Среди клинических форм Malassezia-отитов доминирует церуминозная, Malassezia-дерматитов – себорейная.
4. Основным возбудителем Malassezia-инфекций собак и кошек является вид M. pachydermatis. В 52,4% случаев он является единственным возбудителем, в 25,2% случаев – в ассоциации с бактериями, в 2,8% случаев – в ассоциации с мицелиальными грибами.
5. К Malassezia-отитами предрасположены собаки, относящиеся к брахицефалам (бульдоги, чау-чау, шарпей), и породы с висячими ушными раковинами (бассеты, спаниели). В основном болеют собаки в возрасте старше 6 лет, заболеванию более подвержены самки (60,9%).
6. В 83% случаев развитие Malassezia-инфекций наблюдали на фоне первичных патологий, прежде всего пищевых аллергий, иммунопатий, эндокринных заболеваний, при применении гормональных препаратов и антибиотиков.
7. Экспериментально установлена патогенность M. pachydermatis для животных. LD50 при внутрибрюшинном заражении б. мышей составила 1,41-2,45 млрд/доза в зависимости от штамма; при накожном заражении собак гриб способен вызывать развитие сквамозного дерматита.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
От собак и кошек с клиническими признаками Malassezia-инфекции выделены и паспортизированы этиологические штаммы M. pachydermatis №№:12803, 15003, 15503, 16103, 16903, которые хранятся в отделе контроля качества и стандартизации лекарственных средств против микозов и микотоксикозов животных ФГУ ВГНКИ.
Разработаны и утверждены 05.07.2007 г. «Методические указания по диагностике микозов животных, вызываемых грибами рода Malassezia».
Разработан алгоритм выявления грибов рода Malassezia на покровных тканях животных для применения в ветеринарии.
Разработан метод диагностики микозов животных, вызываемых грибами рода Malassezia, апробированный в Ветеринарном Центре ФГОУ ВПО МГАВМиБ, в ветеринарных клиниках (г. Москва), (г. Москва), «МиГ» (г. Москва), ИП «Семченко» (г. Люберцы), в лечебно-консультативном центре ФГУ ВПО КГАВМ им. Н. Э Баумана (г. Казань), ветеринарной службой Советского района ХМАО-Югра Тюменской области, что подтверждено актами, утвержденных руководителями клиник.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
Разработанный метод лабораторной диагностики Malassezia-инфекций животных рекомендуется для использования в ветеринарных лабораториях и ветеринарных клиниках, что позволит существенно повысить выявляемость Malassezia-инфекций животных.
Метод ватного тампона-зонда рекомендуется для повседневного использования в ветеринарных лабораториях при выявлении грибов рода Malassezia на покровных тканях животных.
Для поддержания и хранения культур M. pachydermatis в лабораторных условиях рекомендуется использование их пересевов на среде Барфатини с интервалом пересевов до 1 мес., криогенное хранение в глицерине (до 3 мес.) и лиофилизация с защитной средой №4 ВГНКИ (хранение до 3 лет).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Маноян грибы при кожных патологиях животных /, , // Золотое кольцо России: Сб. науч. тр. - Владимир: ВНИИВМиВ.- 2001. - С. 87-88.
2. Ершов метод оценки концентрации грибов рода Malassezia у собак / // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Сб. науч. тр.- Владимир: ФГУ ВНИИЗЖС. 149-152.
3. Поверхностные микозы животных, вызываемые дрожжевыми грибами / , , и др.// Успехи медицинской микологии: Сб. науч. тр. – М.: Национальная Академия Микологии Том 8. - С. 192-194.
4. Маноян заболевания животных, вызываемые грибами рода Malassezia / , , // Сборник научных трудов ФГУ ВГНКИ. - М.:ФГУ ВГНКИ– Т. 66. - С. 300-305.
5. Этиологическая роль дрожжевых грибов рода Malassezia в кожных заболеваниях животных / , , и другие// Сборник научных трудов ФГУ ВГНКИ. – М.: ФГУ ВГНКИ.- 2007.-С.12-13.
6. Возрастающая значимость грибов-оппортунистов в этиологии микозов животных / , , и др.// Современная микология в России: Сб. науч. тр. – М.: Национальная академия микологии.- 2008.-Т. 2.- С. 356-357.
7. Ершов клинико-эпизоотологических особенностей Malassezia-инфекций собак и кошек в Московском регионе / // Ветеринарная медицина.- 2008.- № 1.- С. 23-24
