ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Алтайский государственный технический университет
имени »
Бийский технологический институт (филиал)
, ,
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Методические рекомендации по выполнению лабораторного
и научно-исследовательского практикума для студентов всех форм
обучения специальностей 240901 «Биотехнология»
и 260204 «Технология бродильных производств и виноделие»
Бийск 2007
|
|
УДК 576.8.(075.8)
Ламберова, эффективности культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae: методические рекомендации по выполнению лабораторного и научно-исследовательского практикума для студентов всех форм обучения специальностей 240901 «Биотехнология» и 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» / , , .
Алт. гос. тех. ун-т, БТИ. - Бийск.
Изд-во Алт. гос. тех. ун-та, 20с.
Настоящие методические рекомендации содержат общие сведения о классификации, морфологических, физиологических свойствах дрожжей; методики проведения аэробного и анаэробного культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на синтетической питательной среде, содержащей минеральные соли и сахарозу; методики приготовления реактивов и проведения анализа сахаров и этилового спирта в питательной среде и культуральной жидкости. Приведены методы подбора оптимальных условий оживления и культивирования, подсчета числа жизнеспособных клеток дрожжей и посторонней микрофлоры в исходных дрожжах и в конечной суспензии, оценки стерильности и состава питательной среды и эффективности аэробного и анаэробного культивирования в соответствии с производственными нормативными документами.
Рассмотрены и утверждены на
заседании кафедры «Биотехнология».
Протокол № 81 от 01.01.01 г.
Рецензент: к. т.н. зав. кафедрой перерабатывающей
промышленности лицея 22 (г. Бийск)
ã , , 2007
ã БТИ АлтГТУ, 2007
|
|
Введение
Дрожжи различных таксономических групп играют положительную и отрицательную роль в подавляющем числе пищевых и бродильных производств. Особенно широкое применение имеют хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae.
Лабораторный и научно-исследовательский практикумы по специальности 240901 «Биотехнология» по курсам: общая биология и микробиология; особенности микроорганизмов в производственных процессах; биохимия; химия и технология пищевых производств; теоретические основы биотехнологии; общая биотехнология; технология продуктов брожения, а также по специальности 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» по курсам: микробиология; биохимия; пищевая химия; введение в технологию пищевых производств; особенности микроорганизмов в производственных процессах; общая технология отрасли; технология органических кислот; технология дрожжей; технология отрасли (спирт, пиво, вино) и другим предполагают реактивацию и культивирование дрожжей в аэробных и анаэробных условиях на питательных средах с углеводами и оценку эффективности прироста дрожжевой биомассы и продуктов жизнедеятельности дрожжей, имеющих практическую значимость (этиловый спирт, органические кислоты, углекислый газ и др.), оценку качества посевного материала дрожжей, его специфическую стерильность, количественный подсчет клеток дрожжей и посторонней микрофлоры на поверхности агаризованной питательной среды, определение в питательной среде содержания сахарозы, этанола и углекислого газа, а также характеристику эргостерина, биосинтез его в клетке продуцентов, промышленный и лабораторный методы получения эргостерина из биомассы дрожжей.
В данных методических рекомендациях суммированы все необходимые методики и приведен алгоритм действий, предусмотренных производственной нормативной документацией.
1 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
1.1 Задание
Культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae провести в аэробных и анаэробных условиях на питательной среде: сахароза + минеральные соли.
В результате определить следующие показатели:
- убыль субстрата сахарозы из питательной среды в результате их утилизации дрожжами;
- прирост биомассы дрожжей;
- количество выделившегося этанола в питательной среде;
- количество выделившегося углекислого газа;
- эффективность образования биомассы по субстрату;
- эффективность образования этанола по субстрату;
- эффективность образования углекислого газа по субстрату;
- наличие эргостерина в биомассе дрожжей.
1.2 Оценка жизнеспособных клеток дрожжей в сравнении
с количеством посторонней микрофлоры
Перед началом эксперимента необходимо проверить жизнеспособность и чистоту культуры дрожжей.
1.2.1 Приготовление агара питательного
3,8 г готового сухого препарата агара питательного размешиваем в 100 мл дистиллированной воды и нагреваем до полного растворения агара на водяной бане. Фильтруем в колбу на 250 мл, закрываем ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком, стерилизуем автоклавированием в течение 20 минут при температуре 120 °С. Среду охлаждаем до температуры 45-50 °С и разливаем, помещаем в термостат на 48 часов при температуре 37 °С для проверки стерильности.
1.2.2 Приготовление стерильных разведений клеточной
суспензии
Берем 0,1 г сухих дрожжей и заливаем 2 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживаем 1 час при комнатной температуре.
В другом случае берем 1 г прессованных хлебопекарных дрожжей 75%-ной влажности, добавляем 5 мл стерильной дистиллированной воды. Затем (в любом из двух случаев) стерильной пипеткой отбираем 1 мл дрожжевой суспензии, переносим в пробирку, куда доливаем 9 мл стерильной воды. Тщательно перемешиваем содержимое пробирки продуванием воздуха через пипетку. Отбираем из этой пробирки 1 мл суспензии и переносим в пустую стерильную чашку Петри. Еще 1 мл из этой же пробирки переносим в следующую пробирку с 9 мл стерильной воды и т. д. Таким образом засеваем три чашки Петри, получая разведения анализируемой суспензии дрожжей в соотношениях: 1:10; 1:100; 1:1000. Помещаем чашки вверх дном в термостат при 37 °С на 48 часов и проводим подсчет выросших колоний, описываем их цвет, форму, профиль, размеры и микроскопируем.
Проводим микроскопирование каждого вида выросших колоний. Для этого готовим мазки, взяв 2-3 изолированные колонии каждого вида, вносим на обезжиренное этиловым спиртом предметное стекло в каплю дистиллированной воды, подсушиваем, фиксируем их в пламени спиртовки и окрашиваем по Граму:
- на фиксируемый мазок накладываем фильтровальную бумагу, пропитанную карболовым раствором генциана фиолетового, и выдерживаем 2-3 минуты;
- не промывая водой, на мазок наносим на 2-3 минуты раствор Люголя;
- последний, также не промывая водой, сливаем, мазок обрабатываем 96%-ным этиловым спиртом в течение 30-40 секунд;
- хорошо промываем дистиллированной водой;
- дополнительно окрашиваем раствором фуксина (40-50 секунд);
- промываем водой, высушиваем, микроскопируем под иммерсией, зарисовывая и описывая результаты.
Число жизнеспособных клеток дрожжей считаем по формуле:
Х = N/P, (1)
где N - число колоний дрожжей, шт.;
Р - выбранное разведение.
Отношение количества клеток посторонней микрофлоры к числу жизнеспособных клеток дрожжей вычисляем по формуле:
Y=X'/X×100%, (2)
где Х' - число клеток посторонней микрофлоры (определяется аналогично Х).
Процент содержания посторонней микрофлоры не должен превышать 10 %, тогда посевной материал можно использовать в дальнейшем процессе.
Если результаты сравнительного подсчета посторонней микрофлоры по отношению к жизнеспособным клеткам дрожжей в посевном материале неудовлетворительные, проводим его дополнительную обработку. Для этого берем 0,1 г сухих дрожжей (или 1 г прессованных дрожжей 75%-ной влажности), заливаем 5 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживаем при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем подкисляем суспензию серной кислотой до рН = 2,0, выдерживаем в течение 10 мин и устанавливаем рН = 4,0. Делаем три разведения (1:10, 1:100 и 1:1000), засеваем в три чашки Петри с агаром питательным, которые ставим вверх дном в термостат на 48 часов при температуре 37 °С. Затем подсчитываем, описываем и микроскопируем выросшие колонии (см. раздел 2).
1.2.3 Приготовление питательной среды
Солевой состав:
K2HРО4·3Н2О - 0,06550 г;
NH4Cl - 0,10000 г;
MgSO4·7H2O - 0,02000 г;
FeSO4·7H2O - 0,00100 г;
СаСl2 - 0,00075 г;
Вода дистиллированная - 100 мл;
Сахароза - 5 г.
В колбу на 250 мл вносим навески всех солей и 50 мл дистиллированной воды, закрываем ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком и автоклавируем при температуре 120 °С в течение 20 минут.
В другую колбу на 100 мл вносим навеску сахарозы 5 г и 50 мл дистиллированной воды. Закрываем колбу ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком и автоклавируем при температуре 112 °С в течение 20 минут. Затем оба раствора выдерживаем 48 часов в термостате для проверки стерильности, затем стерильно сливаем вместе перед спиртовкой и снова выдерживаем 48 часов в термостате для проверки стерильности готовой жидкой синтетической питательной среды с целью культивирования дрожжей в аэробных или анаэробных условиях.
1.3 Количественное определение сахаров в питательной среде после автоклавирования и культивирования
1.3.1 Приготовление растворов для анализа
1. Раствор сернокислой меди (СuSО4·5H2O) 8%-ный. После приготовления раствор фильтруем.
2. Щелочной раствор сегнетовой соли (С4Н4О6КNa·5Н2О). Едкого натра NaOH 15 г растворяем в мерной колбе на 50 мл дистиллированной водой, все время смешивая до полного растворения, сюда же добавляем 20 г сегнетовой соли, смешиваем до растворения и добавляем воду до метки. Фильтруем в склянку из темного стекла. Храним раствор в темноте.
3. Фелингова жидкость является смесью равных объемов растворов 1 и 2. Готовим непосредственно перед использованием.
4. Раствор марганцевокислого калия. 5 г КМnО4 растворяем в одном литре кипяченой дистиллированной воды, фильтруем в склянку из темного стекла. Через пять дней устанавливаем титр раствора.
Для этого в стеклянном бюксе высушиваем в сушильном шкафу при температуре 120 °С щавелевокислый натрий в течение 2 часов. После остывания бюкса из него в химические стаканы или колбы для титрования берем три навески щавелевокислого натрия по 0,20-0,25 г, приливаем туда же по 50 мл дистиллированной воды и 1-2 мл конценитрированной Н2SO4. Смесь нагреваем до 70 °С, и горячую смесь титруем из бюретки 0,5%-ным раствором КМnО4 до слабо-розового окрашивания. Количество миллилитров, соответствующее 1 мл КМnО4, вычисляем по формуле:
C = B·K/M, (3)
где В - навеска щавелевокислого натрия, мг;
М - количество раствора КМnО4, пошедшего на титрование, мл;
К - коэффициент пересчета (К=0,9483).
Подставив полученные при титровании данные, находим С, затем вычисляем Сср.
0,5%-ный раствор КМnО4 перед титрованием пробы питательной среды разводим в пять раз и получаем 0,1%-ный раствор.
5. Раствор сернокислого окисного железа. 5 г сернокислой окисной соли железа Fe2(SO4)3 растворяем в мерной колбе на 100 мл дистиллированной водой, сюда же добавляем 11 мл концентрированной Н2SО4 (1,84 г/см3). Раствор не должен обладать восстанавливающими свойствами, поэтому к нему по каплям добавляем раствор КМnО4 до появления чуть слабо-розового оттенка. Затем объем раствора доводим до метки.
1.3.2 Ход анализа
В центифужные пробирки вносим по 4 мл питательной среды. Добавляем 4 мл жидкости Фелинга и содержимое перемешиваем. Жидкость должна быть голубой. Если ее цвет стал бурым, это означает, что не хватило жидкости Фелинга и нужно взять меньше питательной среды. Пробирки ставим на 10 мин на кипящую водяную баню до выпадения красно-бурого осадка закиси меди. Затем пробирки охлаждаем в воде, содержимое их центрифугируем при 2000 об/мин в течение пяти минут. Надосадочную жидкость декантируем и край пробирки подсушиваем фильтровальной бумагой. Следить, чтобы осадок не сливался!
Сразу после сливания жидкости к осадку добавляем 2 мл горячей дистиллированной воды, осадок встряхиваем, постукивая пальцами по дну пробирки. Затем приливаем 5-7 мл горячей воды, обмывая ею стенки пробирки, и снова центифугируем, а затем сливаем жидкость. Промывание водой производим 3-4 раза. После промывания осадка в пробирке немедленно приливают 2 мл горячей дистиллированной воды. К взмученному палочкой осадку приливают 3 мл раствора сернокислого оксида железа, продолжая помешивать палочкой до полного растворения осадка закиси меди (палочку оставляем в пробирке).
В результате раствор в пробирке становится зеленоватым. Не вынимая палочки, раствор титруем до бледно-розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 минуты, 0,1%-ным раствором КМnО4, который готовим из 0,5%-ного раствора перед титрованием. Параллельно ставим контроль. Для этого вместо питательной среды берем 4 мл дистиллированной воды. Ход дальнейшей работы тот же, что и с питательной средой. Содержание общего количества сахаров (в процентах) рассчитываем по следующей формуле:
S = (a – b)·(c/5) V 100/(KBV1), (4)
где а - количество раствора КМnО4, пошедшего на титрование питательной среды, мл;
b - количество раствора КМnО4, пошедшего на титрование контрольной пробы, мл;
с/5=10; 13/5=2,026 (определение описано выше);
К - коэффициент пересчета, равный 1,9;
В - масса сахарозы, мг;
V - общий объем питательной среды, мл;
V1 - объем среды, взятый на анализ, мл;
100 - коэффициент для пересчета в проценты.
1.4 Культивирование дрожжей в аэробных условиях
1.4.1 Подготовка посевного материала дрожжей
В пробирку помещаем 0,5 г сухих дрожжей, туда же заливаем
5 мл стерильной дистиллированной воды, оставляем на 1 час при комнатной температуре (или 5 г прессованных дрожжей заливаем 5 мл стерильной дистиллированной воды), затем подкисляем концентрированной серной кислотой до рН = 2,0 и выдерживаем 10 минут; после этого доводим рН до 4,0, добавив несколько капель раствора NаОН. Центрифугируем суспензию дрожжей при 2000 об/мин в течение
10 минут. Взвешиваем осадок, который представляет собой оживленные дрожжи.
1.4.2 Посев клеток на проверенную стерильную
питательную среду
В стерильных условиях помещаем подготовленный посевной материал дрожжей (инокулят) в проверенную в термостате жидкую питательную среду, колбу закрываем ватно-марлевой пробкой и закрепляем на термостатированной качалке, установив следующий режим: cкорость 130 об/мин, амплитуда 2, температура 37 °С. Ежедневно колбу взвешиваем. Результаты взвешивания записываем. Культивирование прекращают, когда вес колбы стабилизируется и перестанет меняться.
1.4.3 Оценка прироста биомассы дрожжей
Культуральную жидкость разделяем на центрифуге (10 минут, 2000 об/мин) на жидкую часть и осадок биомассы дрожжей, который затем взвешиваем. По разнице начальной и конечной массы дрожжей 100%-ной влажности (если исходная влажность дрожжей отличалась от 100 %, предварительно сделать пересчет массы) определяем прирост биомассы дрожжей в процессе их аэробного культивирования (DX).
1.4.4 Определение убыли сахаров в питательной среде
Содержание сахаров в культуральной жидкости определяем по методике, описанной ранее (см. п. 1.3). Затем убыль сахаров находим по разнице между начальной и конечной величиной (DS).
1.4.5 Определение экономического коэффициента
по приросту биомассы дрожжей
Расчет экономического коэффициента по приросту биомассы дрожжей провести по формуле:
YX/S = DX/DS, (5)
где DX – прирост биомассы дрожжей после культивирования, г;
DS – убыль сахаров в культуральной жидкости в результате культивирования дрожжей, г.
1.5 Культивирование дрожжей в анаэробных условиях
1.5.1 Подготовка посевного материала
Подготовка посевного материала дрожжей осуществляется по 1.4.1.
1.5.2 Посев клеток на проверенную среду
В колбу помещаем дрожжи, закрываем герметично корковой пробкой, в центр которой с помощью иголки для шприца вставлена пластиковая трубочка, другой конец последней опускаем в стакан, куда через трубочку выходит образующийся СО2. Заполненную установку ставим в термостат с температурой 37 °С. Ежедневно колба взвешивается до тех пор, пока вес не перестанет меняться.
Затем проводим оценку прироста биомассы дрожжей по 1.4.3 и убыль сахаров в культуральной жидкости по 1.4.4 и рассчитываем экономический коэффициент YX/S по 1.4.5.
1.5.3 Определение количества выделившегося СО2
Диоксид углерода, образующийся при брожении, определяем по разности масс колбы до брожения и после него с учетом прибыли биомассы и убыли сахаров.
1.5.4 Качественное определение образовавшегося спирта
Установка для перегонки спирта приведена на рисунке 1.
В колбу 3 наливаем 60-70 мл культуральной жидкости. Перегоняем две трети содержимого колбы в приемник.
Качественное определение спирта основано на окислении этанола до уксусной кислоты и воды смесью бихромата калия с серной кислотой:
3СН3СН2ОН+2К2Сr2О7+8Н2SO4=3СН3СООН+2Сr(SO4)2+Н2SО4+11Н2О.
Отбираем 5-10 мл перегнанной жидкости, капаем несколько капель концентрированной Н2SО4 и помещаем туда же несколько кристаллов бихромата калия. Смесь ставим на плитку, нагреваем.
1 - плитка; 2 - водяная баня; 3 - круглодонная колба;
4 - насадка Вюрца; 5 - термометр; 6 - холодильник Либиха;
7 - алонж; 8 - приемник
Рисунок 1 - Установка для перегонки спирта
Через некоторое время смесь меняет цвет с желто-коричневого на зеленый и ощущается запах яблочного уксуса. Это указывает на наличие спирта. Весовым или массовым способом определяем количество образовавшегося этанола (DР).
1.5.5 Определение экономического коэффициента
образования этанола
Расчет экономических коэффициентов образования этанола провести по формулам:
YР/S = DР/DS, (6)
где DР – прирост этанола после анаэробного культивирования, г;
DS – убыль сахаров в культуральной жидкости в результате анаэробного культивирования дрожжей, г;
YР/Х = DР/DХ, (7)
где DР – прирост этанола после анаэробного культивирования, г;
DХ – прирост биомассы дрожжей в результате анаэробного культивирования, г.
Аналогично рассчитывают экономические коэффициенты по образовавшемуся углекислому газу.
1.6 Получение эргостерина из биомассы дрожжей
1.6.1 Характеристика эргостерина
Эргостерин [ мол. масса 396,66].
Эргостерин является провитамином витамина D.
1.6.2 Лабораторное получение эргостерина
1.6.2.1 Сырье и материалы
Дрожжи - 20 г;
Едкий калий - 3 г;
Спирт этиловый - 33 мл;
1.6.2.2 Ход работы
В колбу, вместимостью 250 мл, загрузить 10 г дрожжей, 1,5 г едкого калия, 15 мл спирта.
Смесь постоянно перемешивать в течение 6 часов при температуре 78-84 °С на термостатированной качалке с водяной баней. После этого смесь отфильтровать. Далее этот концентрат упарить до содержания сухих веществ 36-39 %.
Во время упаривания из-за содержания большого количества белка концентрат вспенивается. Пену убирать путем прекращения на несколько секунд подачи воздуха в аппарат. Эту операцию повторять многократно в течение примерно 7-8 часов. После того как белок гидролизовался, пена в растворе исчезает. Дальше упаривание продолжать в течение пяти часов до густого, тягучего состояния, содержание сухих веществ в котором примерно 36-39 %. Цвет концентрата после упаривания темно-коричневый.
После упаривания практически твердый концентрат растворить в 10 мл этилового спирта и выдержать в термостатированной качалке при 78 °С до получения однородного коричневого раствора. Затем колбу охладить и поставить в холодильник при 0 °С до выпадения кристаллов эргостерина. Выпавшие кристаллы отфильтровать на фильтре Шота. Провести очистку кристаллов путем перекристаллизации последовательным промыванием 70%-ным этиловым спиртом, смесью спирта с бензолом (80:20) и повторной перекристаллизацией. Полученные кристаллы эргостерина высушить и измерить температуру плавления.
1.6.3 Качественные реакции на витамины группы D
1.6.3.1 Оборудование и реактивы
Пипетки с одной меткой на 1 мл (4 шт.); штатив лабораторный с пробирками; баня водяная; рыбий жир; анилин; раствор брома в хлороформе (1:60); соляная кислота (конц.).
1.6.3.2 Реакция с анилином
В сухую пробирку наливают 1 мл рыбьего жира и 1 мл смеси анилина с концентрированной соляной кислотой (15:1), перемешивают, осторожно нагревают при постоянном помешивании до кипения и кипятят 0,5 минут. При наличии витамина D желтая окраска эмульсии переходит сначала в зеленую, а затем в красную. Через 1-2 минуты эмульсия делится на два слоя, из которых нижний окрашен в интенсивный красный цвет.
1.6.3.3 Бромхлороформная проба
В сухую пробирку наливают 1 мл рыбьего жира и 1 мл раствора брома в хлороформе (1:60). В присутствии витамина D возникает зеленовато-голубое окрашивание при нагревании на водяной бане в течение 1-2 минут.
1.6.4 Количественное определение витамина D
1.6.4.1 Оборудование и реактивы
Фотоэлектроколориметр; баня водяная; воронка делительная на 300 мл (2 шт.); коническая колба с притертой пробкой на 200 мл; набор пипеток градуированных на 1, 5 и 10 мл; молочный жир; этиловый спирт (96%-ный); гидроксид калия (50%-ный); диэтиловый эфир; сульфат натрия свежепрокаленный; хлороформ (промытый водой, высушенный над безводным сульфатом натрия и перегнанный); хлорид сурьмы (III) (21-23%-ный) в хлороформе (безводный; рекомендуется хранить в темной склянке в эксикаторе над серной кислотой); ацетилхлорид; основной раствор кальциферола (в 100 мл этилового спирта растворяют 10 мг кальциферола, что соответствует ИЕ витамина D2; раствор устойчив в течение года при хранении в холодильнике).
1.6.4.2 Ход анализа
В коническую колбу с воздушным обратным холодильником длиной 80 см вносят 10 г молочного жира, 40 мл 96%-ного этилового спирта и 8 мл 50%-ного раствора гидроксида калия. Колбу помещают в водяную баню, нагретую до температуры 85-90 °С, на 40-50 минут. По окончании омыления содержимое колбы количественно переносят в делительную воронку и трижды экстрагируют диэтиловым эфиром (порциями 50, 25 и 25 мл). Эфирный слой переносят в другую делительную воронку, где промывают его многократно водой до полного удаления щелочи (проба на фенолфталеин). К полученному эфирному экстракту добавляют 7 г свежепрокаленного сульфата натрия и высушивают его до полной прозрачности (15-20 мин), после чего фильтруют через бумажный фильтр. Эфир отгоняют на предварительно нагретой водяной бане до получения сухого остатка, который растворяют в 5 мл хлороформа. Из полученного раствора отбирают 1 мл, добавляют 3 капли ацетилхлорида и 6 мл раствора хлорида сурьмы (III). Через
4 минуты интенсивность окраски измеряют в фотоэлектроколориметре при 500 нм. Фотометрирование ведут против смеси из 1 мл хлороформа, 6 мл раствора хлорида сурьмы (III) и трех капель ацетилхлорида. Содержание витамина D рассчитывают по калибровочному графику. Для получения калибровочного графика готовят серию растворов кальциферола в хлороформе, содержащих в 1 мл от 200 до 1000 ИЕ витамина D, используя для этого основной раствор кальциферола и проводя цветную реакцию, как указано выше. Расчет ведут по формуле:
С = х·V·r/a, (8)
где С - содержание витамина D в 1 г жира, ИЕ;
х - найденное по калибровочному графику количество витамина D в 1 мл раствора, ИЕ;
V - масса жира, г;
r - плотность жира, г/см3.
2 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
2.1 Общая характеристика дрожжей
Термином «дрожжи» обозначают одноклеточные эукариотные микроорганизмы. В группу дрожжей объединяются грибы, которые существуют преимущественно в виде отдельных клеток. Клетки разных видов дрожжей морфологически довольно разнообразны: круглые, яйцевидные, лимоновидные, овальные. Длина их составляет 2-20 мкм, а ширина 1,5-10 мкм. Размножаются дрожжи вегетативно и половым путем. Клетки дрожжей грамположительны. На плотных питательных средах дрожжи растут в виде врастающих в субстрат колоний, имеющих мягкую консистенцию и разнообразных по форме: выпуклых, круглых, лопастных. Колонии могут быть бесцветными или окрашенными в желтый, оранжевый, розовый цвета (рисунок 2).
Рисунок 2 - Гигантские колонии дрожжей разных видов на сусло-агаре
В зависимости от наличия и типа полового процесса дрожжи относят к трем классам грибов: Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes. Термин «дрожжи» в строгом смысле не имеет таксономического значения.
К классу Ascomycetes относят дрожжи, образующие при половом размножении сумки (аски) с эндогенными спорами. К нему принадлежат представители родов дрожжей, используемых в бродильных производствах, Saccharomyces и Shizosaccharomyces.
Класс Basidiomycetes включает дрожжи, формирующие телиоспоры (телейтоспоры) и базидиоподобные спорофоры с экзогенными половыми спорами (споридиями).
К Deuteromycetes, или несовершенным грибам, относят дрожжи, у которых не обнаружен половой цикл. Считают, что организмы, принадлежащие к этой группе, произошли от высших грибов в результате утраты ими половых функций.
В процессе эволюции дрожжи хорошо приспособились к обитанию в различных местах, содержащих чаще всего углеводы.
Они растут на поверхности сладких плодов, в нектаре цветков, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в лесной подстилке и почве. Встречаются дрожжи и в водоемах. Содержатся они в пищеварительном тракте человека и животных. Большинство дрожжей сапрофиты, но среди видов, находящихся и во внутренних органах и на кожных покровах человека, имеются патогенные, или условно патогенные, формы, например, возбудитель кандидомикозов - Candida albicans. Некоторые дрожжи вызывают болезни растений.
Многие дрожжи осуществляют спиртовое брожение и используются для производства пива, вина, хлеба, спирта. Биомасса кормовых дрожжей рода Саndida используется в качестве питательных добавок к рационам сельскохозяйственных животных.
2.2 Систематика дрожжей
Одноклеточная организация дрожжей накладывает столь существенный отпечаток на их внешний облик и на методы работы с ними, что систематика дрожжей долгое время развивалась вполне независимо от систематики мицелиальных грибов. Одно из важных отличий - широкое использование для классификации и идентификации дрожжей физиологических и биохимических признаков. До середины XX века все одноклеточные грибы рассматривались в качестве достаточно обособленной таксономической группы аскомицетов. Последней точки зрения придерживался, например, , автор отечественного определителя дрожжей, который предлагал объединять все дрожжи в самостоятельный порядок Unicellomycetales. В середине XX века произошло принципиальное событие в систематике дрожжей, когда японскому микологу Исао Банно удалось индуцировать половой цикл размножения у гетероталличных красных дрожжей Rhodotorula glutinis. Полученные им характеристики жизненного цикла однозначно свидетельствовали о принадлежности этих дрожжей к гетеробазидиомицетам. Стало очевидным, что среди дрожжей имеются представители совершенно различных таксономических групп грибов - как аскомицетовых, так и базидиомицетовых. После этого большое внимание в систематике дрожжей стало уделяться поиску признаков, позволяющих разделить аскомицетовые и базидиомицетовые виды, даже без наблюдения полного жизненного цикла (так называемых признаков аффинитета). В систематике дрожжей стали активно использоваться биохимические и цитологические признаки.
Современный период изучения биологического разнообразия характеризуется интенсивным развитием филогенетической систематики, которая направлена на реконструкцию конкретных путей исторического развития организмов. В микробиологии филогенетическая систематика получила мощный импульс развития лишь в самом конце XX века в связи со сравнительным изучением консервативных нуклеотидных последовательностей в рРНК. У дрожжей такая систематика строится главным образом на изучении двух участков рДНК длиной около 600 нуклеотидных пар: D1/D2 домена на 5'-конце гена, кодирующего 26S рРНК и внутреннего транскрибируемого спейсерного региона (ITS), включающего ген 5.8S рРНК. Считается, что вследствие консервативности этих участков различия между ними прямо пропорциональны филогенетическому расстоянию, степени эволюционного родства. Сек-венирование неклеотидных последовательностей рДНК оказалось мощным инструментом для построения филогенетической классификации дрожжей, определения их места в общей системе грибов. К настоящему времени расшифрованы и помещены в компьютерные банки данных, доступные по сети Интернет, нуклеотидные последовательности рРНК у представителей всех известных видов дрожжей. Это позволило построить филогенетические деревья, отражающие эволюцию их рибосомальных генов. Оказалось, что группирование дрожжей на основе сходства нуклеотидных последовательностей рРНК во многих случаях не совпадает с группированием по фенотипическим признакам. Многие традиционные признаки, используемые в классификации дрожжей, такие как характеристики вегетативного размножения, форма аскоспор, способность к сбраживанию и ассимиляции сахаров, стали считаться ненадежными, не пригодными для определения филогенетического родства. Секвенирование рРНК (рДНК) сейчас считается необходимым при описании новых видов дрожжей.
Один из главных вопросов, который активно дискутировался до последнего времени, - положение дрожжей в общей системе грибов. Являются ли они предковыми примитивными формами аско - и базидиомицетов, давшими начало более продвинутым и сложно организованным мицелиальным грибам, или вторично упростившимися, возникшими независимо в разных филогенетических линиях грибов в результате конвергенции? Окончательный ответ на этот вопрос был получен лишь недавно в результате развития молекулярно-филогене-тической систематики. Сейчас считается окончательно доказанным полифилетическое происхождение дрожжей, их независимое возникновение среди аскомицетовых и базидиомицетовых грибов. После обнаружения базидиомицетовых дрожжей в зимологии возникло представление о дрожжах, как о чисто морфологической, или экоморфологической группе грибов (жизненной форме), лишенной таксономического содержания. В то же время дрожжи встречаются лишь в некоторых филогенетических линиях грибов, в которых имеются также близкородственные виды, существующие в основном в мицелиальной форме. Примерами могут служить аскомицеты Endomyces, Blastobotrys, базидиомицеты Tilletiopsis, Trichosporonoides, не образующие почкующиеся одиночные клетки. Несмотря на отсутствие одноклеточных ассимилятивных стадий, такие виды также включают в определители дрожжей, так как филогенетически они очень близки к «настоящим» одноклеточным дрожжам. Поэтому, с точки зрения филогенетической систематики, целиком сводить понятие «дрожжи» только к одноклеточной жизненной форме грибов не представляется целесообразным.
Систематика дрожжей, поиск их места в общей системе грибов продолжают активно развиваться, и в этой области еще не выработано устоявшихся, стабильных представлений. Тем не менее со времени первых описаний сахаромицетов зимологами пройден очень большой путь в исследовании разнообразия дрожжевых грибов. Основные этапы этого пути отражены в серии определителей голландской зимологической школы, которые выходили с интервалом в 10-20 лет.
2.3 Классификация дрожжей
Классификация дрожжей на уровне семейств и порядков разработана очень слабо. За основу приводимой ниже классификации взято последнее издание определителя дрожжей (Kurtzman C. P., Fell J. W. (eds.) The Yeasts, a taxonomic study. Fourth revised and enlarged edition. Amsterdam: Elsevier Science B. V., 1998).
2.3.1 Аскомицетовые дрожжи
Традиционно все аскомицетовые грибы разделяли на два таксономических класса: Hemiascomycetes, или голосумчатые грибы, и Euascomycetes (настоящие аскомицеты). Первые не образуют плодовых тел, и аски у них располагаются непосредственно на мицелии или в виде одиночных клеток, тогда как эуаскомицеты, за немногими исключениями (например, род Eremascus), обычно формируют аски внутри или на поверхности специальных плодовых тел (аскокарпов), образованных грибной тканью - густым скоплением мицелия. Ранее все аскомицетовые дрожжи помещали в группу гемиаскомицетовых в качестве самостоятельного порядка Endomycetales. Кроме настоящих дрожжей к эндомицетовым относили и некоторые голосумчатые грибы, не образующие одноклеточных вегетативных форм, а также диморфные дрожжеподобные грибы, иногда с очень слабо выраженной дрожжевой фазой, например, Ascoidea, Cephaloascus, Dipodascus. Дальнейшее разделение эндомицетовых дрожжей на семейства и роды проводилось прежде всего на основании таких признаков, как способ вегетативного размножения, тип полового процесса и форма аскоспор. Например, дрожжи рода Schizosaccharomyces выделяются на основании вегетативного размножения делением, а не почкованием, роды Hanseniaspora, Nadsonia, Saccharomycodes - на основании размножения биполярным почкованием на широком основании, роды Saccharomyces, Pichia, Metschnikowia, Williopsis характеризуются шаровидной, шляповидной, игловидной и сатурновидной формой аскоспор соответственно.
Кроме эндомицетовых к гемиаскомицетам формально относили еще одну группу грибов, составляющую отдельный порядок Taphrinales. Все представители этого порядка - облигатные паразиты растений, образующие аски не в плодовых телах, а плотным слоем под кутикулой растения-хозяина. Аскоспоры некоторых видов тафриновых способны почковаться, формируя сапротрофную дрожжевую фазу. Однако тафриновые существенно отличаются от остальных гемиаскомицетов тем, что в цикле их развития преобладает дикариотическая фаза так же, как у базидиомицетовых грибов. К тафриновым очень близки представители рода Protomyces, все члены которого тоже являются фитопатогенными грибами, но способны образовывать сапротрофные дрожжевые стадии.
Среди эуаскомицетов способность к вегетативному размножению в одноклеточной форме встречается очень редко. Наиболее известны так называемые «черные дрожжи», характеризующиеся накоплением меланоидных пигментов, которые придают их колониям черный цвет.
Внедрение в таксономическую практику биохимических и молекулярно-биологических методов (особенно проведенный в последнее время анализ нуклеотидных последовательностей рРНК) существенно изменило представления о филогенетической классификации аскомицетовых дрожжей. Эти исследования подтвердили разделение аскомицетов на две главные филетические линии: гемиаскомицетовые и эуаскомицетовые.
Наряду с этим обнаружилось, что дрожжи рода Schizosac-charomyces по нуклеотидным последовательностям рРНК наиболее близки к тафриновым и вместе с ними образуют группу дрожжевых грибов, предковую по отношению к остальным аскомицетам. Эта группа грибов была названа архиаскомицетами (древними аскомицетами). Таким образом, все аскомицетовые дрожжи в настоящее время распределяются по трем классам Archiascomycetes, Hemiascomycetes, Euascomycetes (рисунок 3).
2.3.1.1 Saccharomyces
Клетки овальные или круглые, иногда удлиненные, размером (5…7)´(8…11) мкм. Размножаются многосторонним почкованием. Почкование истинное (рисунок 4). Может формироваться примитивный псевдомицелий, но истинного мицелия не образуют.
Диплоидизация происходит в результате слияния двух гаплоидных клеток (хологамия). Вегетативно размножаются в основном диплоидные клетки. В неблагоприятных условиях образуются аски с одной или четырьмя спорами. При созревании спор сумки-аски не вскрываются и сохраняются. Аскоспоры имеют круглую, слегка овальную форму, гладкие, бесцветные. Аски образуются преимущественно из вегетативных диплоидных клеток (рисунок 5).
Дрожжи рода Saccharomyces активно сбраживают сахара, нитраты не ассимилируют, так как не имеют ферментов, способных восстанавливать их до ионов аммония. На поверхности агара питательного они обычно формируют гладкие тускло блестящие белые с желтым оттенком колонии.
Дрожжи вида Saccharomyces cerevisiaе способны сбраживать глюкозу, сахарозу, частично раффинозу, мальтозу и декстрины. На гидролизных средах выход спирта составляет 55-57 литров из 100 кг сбраживаемых сахаров. Поэтому дрожжи вида Saccharomyces cerevisiaе являются одним из основных продуцентов этанола на углеводных средах. Дрожжи этого рода с давних времен распространены в кустарном виноделии и широко используются в разных отраслях бродильной промышленности, в связи с чем они более всех других дрожжей изучены в разных аспектах. Их систематика, однако, многократно пересматривалась. Центральный вид - S. cerevisiae - известен в десятках синонимов, которые в настоящее время рассматриваются как производственные расы, но не самостоятельные виды.
Класс Archiascomycetes Семейство Saccharomycetaceae
Arxiozyma
Порядок Schizosaccharomycetales Citeromyces
Schizosaccharomyces Cyniclomyces
Порядки Taphrinales и Debaryomyces
Protomycetales Dekkera
Taphrina (анаморфа - Issatchenkia
Lalaria) Kluyveromyces
Protomyces Lodderomyces
Pachysolen
Класс Hemiascomycetes Pichia (=Hansenula)
Порядок Saccharomycetales Saccharomyces
Семейство Ascoideaceae Saturnispora
Ascoidea Torulaspora
Williopsis
Семейство Cephaloascaceae Zygosaccharomyces
Cephaloascus
Семейство Saccharomycodaceae
Семейство Dipodascaceae Hanseniaspora
Dipodascus Nadsonia
Galactomyces Saccharomycodes
Sporopachydermia Wickerhamia
Stephanoascus
Wickerhamiella Семейство Saccharomycopsidaceae
Yarrowia Ambrosiozyma
Zygoascus Saccharomycopsis
Семейство Endomycetaceae
Endomyces Класс Euascomycetes
Семейство Eremotheciaceae Oosporidium
Eremothecium «Черные дрожжи»
Coccidiascus Анаморфные роды
Семейство Lipomycetaceae Aciculoconidium
Babjevia Arxula
Dipodascopsis Blastobotrys
Lipomyces Botryozyma
Zygozyma Brettanomyces
Семейство Metschnikowiaceae Candida
Clavispora Geotrichum
Metschnikowia Kloeckera
Myxozyma
Schizoblastosporion
Sympodiomyces
Trigonopsis
Рисунок 3 - Классификация аскомицетовых дрожжей
Рисунок 4 – Многостороннее почкование у Saccharomyces cerevisiae
1 - почкующиеся клетки; 2 - аски со спорами
Рисунок 5 – Saccharomyces cerevisiae
В последнем руководстве по дрожжам (N. Kreger-van-Rij, 1984) к роду Saccharomyces отнесено семь видов, размножающихся вегетативно преимущественно в диплоидной фазе: Sacch. cerevisiae, Sacch. kluyveri, Sacch. exiguus, Sacch. dairensis, Sacch. servazzii, Sacch. tellustris, Sacch. unisporus. Как синонимы Sacch, cerevisiae рассматриваются Sacch. bayanus, Sacch. carlsbergensis и ряд других промышленно важных доожжей.
Наибольшее значение имеет Sacch. cerevisiae. К этому виду относятся расы дрожжей, используемые в хлебопечении, спиртовом производстве, пивоварении, виноделии, производстве кваса (см. раздел 3). Поэтому приводим характеристику вида Saccharomyces cerevisiae Hansen.
На солодовом сусле в трехсуточной культуре при 28 °С клетки имеют сферическую, эллипсоидальную или несколько удлиненную формы; располагаются единично или парами, иногда образуют короткие цепочки или мелкие грозди (см. рисунок 5). В зависимости от размера клеток штаммы этого вида можно разделить на три морфологические группы.
К первой группе относятся штаммы, имеющие самые крупные клетки (3,5…10,5´5,0…21,0 мкм), ко второй - наименьшие (2,5…7,0´11,0…19,0 мкм), к третьей - промежуточные (3,5…8,0´5,0…11,5 до 18,0 мкм) клетки. Некоторые штаммы образуют удлиненные клетки, достигающие 30 мкм и более.
Колонии у этих дрожжей пастообразные, кремовые или коричневато-кремовые, обычно с довольно ровной, гладкой, иногда слегка пузырчатой или покрытой точками поверхностью, с блестящими или тусклыми секторами. Край колоний цельный, иногда лопастный, изредка образуется примитивный псевдомицелий.
Аскообразование легко вызвать при высеве дрожжей на агар с ацетатом. Аски обычно содержат от одной до четырех спор шаровидной или эллипсоидальной формы. Сбраживают глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу и на 1/3 раффинозу. В аэробных условиях используют глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, на 1/3 раффинозу. Способность к использованию L-сорбозы, трегалозы, мелецитозы, инулина, L-арабинозы, D-рибозы, глицерина, D-маннита, D-сорбита,
a-метил-6-глюкозида и молочной кислоты варьирует. Не ассимилируют целлобиозу, лактозу, мелибиозу, крахмал, ксилозу, D-арабинозу,
L-рамнозу, эритрит, рибит, дульцит, салицин, янтарную и лимонную кислоты, инозит. Не используют в качестве источника азота NО3. Штаммы имеют различную способность расти на средах в отсутствие витаминов.
Штаммы Sacch. cerevisiae подразделяют на расы низового и верхового брожения. К расам низового брожения относится большинство винных и пивных дрожжей, к расам верхового - спиртовые, хлебопекарные и некоторые пивные. Дрожжи низового брожения функционируют в производстве при температуре от 6 до 10 °С и ниже (до 0 °С), а верхового - обычно температуре от 14 до 25 °С.
В конце брожения низовые дрожжи оседают на дно, формируя плотный осадок, верховые всплывают на поверхность и образуют «шапку». Способность последних подниматься на поверхность обусловлена тем, что клетки после почкования остаются соединенными в небольшой цепочке; пузырьки углекислого газа поднимают их на поверхность. Оба свойства, однако, не абсолютны.
По поведению в бродящей среде дрожжи разделяют также на хлопьевидные и пылевидные. В основе этого разделения лежит различие в их флоккуляционных свойствах (флоккуляция - обратимая агрегация, или агглютинация, клеток).
Хлопьевидные дрожжи в конце брожения слипаются в комки («флоккулы») и либо оседают на дно, либо поднимаются на поверхность. Пылевидные дрожжи в течение всего процесса брожения находятся во взвешенном состоянии. Флоккулируют дрожжи как низового, так и верхового брожения. Клетки хлопьевидных дрожжей крупнее и тяжелее, чем пылевидных; последние особенно подвержены автолизу. Пылевидные дрожжи дают меньший прирост биомассы, но обладают более высокой бродильной активностью и полнее сбраживают сусло, образуют больше диацетила и высших спиртов. Хлопьевидные дрожжи лучше создают аромат напитков. Способность дрожжей к хлопьеобразованию не является стойким признаком, и штаммы могут ее постепенно утрачивать.
2.4 Распространение дрожжевых грибов в природе
Особенности распространения дрожжей в природе стали интересовать микробиологов, начиная с самых первых исследований процессов традиционного виноделия. Первоначально изучение дрожжей ограничивалось теми видами и штаммами, которые вызывали брожение при приготовлении пива и вина. Однако уже в конце XIX века М. Бейеринк высказывал мысль о том, что эти культурные виды представляют собой селекционированные формы «диких» дрожжей, широко распространенных в природе. Естественно, возник вопрос об источниках их попадания в бродящие субстраты. Первые исследования, выполненные основателями зимологии Э. Хансеном и А. Клекером, были посвящены именно этой теме - поиску природных источников винных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В нашей стране этому вопросу также уделяли внимание крупнейшие микробиологи, например, . Сахаромицеты были найдены на ягодах винограда, однако, как оказалось, преобладают здесь совсем иные виды дрожжей, не участвующие в последующем сбраживании виноградного сока. Еще реже встречались сахаромицеты в окружающих субстратах, в частности, в почве под виноградниками. Уже в ранних работах высказывалось предположение, что почва не является средой, в которой возможно активное развитие дрожжевых грибов, а служит для последних лишь своеобразной «ловушкой», где дрожжи могут сохраняться определенное время в жизнеспособном состоянии и служить источником спор для инфицирования винограда нового урожая. Таким образом, возникло понятие «круговорота дрожжей» в природе. Под «дрожжами» в то время подразумевались одноклеточные аскомицетовые грибы, родственные сахаромицетам и способные к активному брожению.
Расширяющиеся микологические исследования приводили к обнаружению все новых видов дрожжевых грибов, в том числе и таких, которые существенно отличались от типичных сахаромицетов. Оказалось, что многие из одноклеточных грибов, выделяемых из природных источников, не образовывали аскоспор и вообще не были способны к сбраживанию сахаров. Для таких дрожжей был предложен род Тоrulа, давший затем начало целой серии родов несовершенных дрожжей (Torulopsis, Candida, Rhodotorula, Cryptococcus), виды которых часто обнаруживаются в самых различных природных субстратах, включая почву, растения, разнообразные растительные остатки и природные воды. Стало понятным, что дрожжи распространены довольно широко, и их развитие далеко не ограничивается субстратами традиционных бродильных процессов. Однако при этом существенно изменилось и содержание самого понятия «дрожжи». Дрожжами стали называть любые одноклеточные грибы, не обязательно вызывающие спиртовое брожение. В то же время, несмотря на существенные отличия между сахаромицетами и небродящими дрожжевыми грибами, достаточно долго сохранялось представление о дрожжах как самостоятельной филогенетической линии грибов. Лишь после обнаружения у несовершенных дрожжей рода Rhodotorula полного жизненного цикла, типичного для телиоспоровых гетеробазидиомицетов, термин «дрожжи» окончательно утратил таксономическое содержание. Тем не менее вплоть до настоящего времени дрожжи продолжают рассматриваться в качестве единой группы, представляющей собой особую жизненную форму, или экоморфу грибов.
Дело в том, что все дрожжи обладают очень сходным обликом за счет роста преимущественно в виде одиночных клеток. Кроме того, с одноклеточной организацией дрожжей сопряжены многие их физиологические особенности, в частности, узкий спектр усваиваемых соединений, отсутствие способности к гидролизу труднодоступных полимеров, особенно таких, как целлюлоза и лигнин, быстрый рост за счет потребления простых углеводов. Особенно характерен этот набор признаков для аскомицетовых дрожжей. Все это делает их более приспособленными к обитанию в жидких и мелкодисперсных средах, богатых легкодоступными источниками углерода, в то время как мицелиальные грибы получают преимущество при росте на плотных поверхностях. Одноклеточность у грибов - вторичное явление в их эволюции, которое возникало независимо в разных группах аско - и базидиомицетов как реакция на существование в жидких и полужидких средах с относительно высокой концентрацией легкодоступных источников питания.
Действительно, дрожжи - наиболее типичные обитатели природных субстратов, характеризующихся высоким содержанием легкодоступных питательных веществ (сахаров, сахароспиртов, органических кислот и т. п.). В таких субстратах популяции отдельных видов дрожжей могут достигать очень высоких значений численности и даже доминировать в микробном населении. Многие из подобных природных местообитаний неоднократно привлекали внимание зимологов и служили источниками выделения самых различных видов дрожжей.
2.5 Особенности метаболизма дрожжей
2.5.1 Физиология дрожжей
Хотя дрожжи и не так разнообразны по своему метаболизму, как бактерии, различные виды дрожжей могут катаболизировать разные соединения углерода и азота и образовывать различные конечные продукты (рисунок 6).
Из соединений углерода дрожжи, как правило, лучше всего используют гексозы. Некоторые виды хорошо растут на средах с пентозами. Из полисахаридов чаще всего утилизируют инулин и крахмал. Известны дрожжи, растущие на средах с углеводородами и некоторыми спиртами, в том числе метанолом и этанолом, а также органическими кислотами и другими углеродными cyбстратами.
В качестве источника азота дрожжи используют обычно соли аммония, аминокислоты, небольшие пептиды, реже нитраты и нитриты. Некоторые виды нуждаются в одном или более витаминах (чаще в биотине и тиамине), другие способны все необходимые для роста витамины синтезировать сами.
Рисунок 6 – Общая схема метаболизма дрожжей
Большинство дрожжей растет в границах рН от 3,0 до 8,0, оптимальные значения рН от 3,5 до 6,5. Общий диапазон температур для роста дрожжей широкий: от 0 (даже минус 7 °С) до 48-50 °С. Оптимальная температура для роста большинства видов 28-30 °С, но некоторые расы дрожжей, например, используемые в пивоварении, имеют более низкий температурный оптимум. Известны облигатно психрофильные дрожжи, не растущие при температуре выше 18-20 °С. Многие дрожжи - факультативные анаэробы. В условиях анаэробиоза они получают энергию в результате сбраживания углеводов, а в присутствии молекулярного кислорода - за счет аэробного дыхания.
2.5.2 Спиртовое брожение
Наиболее известное свойство многих дрожжей - способность к спиртовому брожению. Многие виды дрожжей могут переключаться с бродильного метаболизма на дыхательный и обратно в зависимости от условий: при наличии кислорода брожение ингибируется и дрожжи начинают дышать, в отсутствие кислорода включается механизм спиртового брожения. Так как кислородное дыхание - энергетически более выгодный процесс, чем брожение, то выход биомассы дрожжей в расчете на единицу используемого субстрата выше при выращивании их в аэробных условиях, чем в анаэробных. Это явление называется эффектом Пастера.
Спиртовое брожение может идти не только в анаэробных условиях. Если выращивать дрожжи в присутствии кислорода, но при высоком содержании глюкозы в среде, то в этом случае дрожжи также сбраживают глюкозу. Таким образом, глюкоза подавляет процессы анаэробного дыхания. Это явление получило название эффекта Кребтри, или катаболитной репрессии.
Многие дрожжи вообще не способны бродить. По соотношению между этими двумя процессами в метаболизме можно выделить следующие группы дрожжей:
1. Дрожжи, существующие только за счет брожения и не способные расти в аэробных условиях. К ним относится, например, Arxiozyma telluris, обитающий в кишечном тракте грызунов.
2. Активные бродильщики интенсивно сбраживают различные субстраты, но в аэробных условиях переключаются на дыхательный обмен. Представители - Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe.
3. Слабые бродильщики в основном существуют за счет аэробного дыхания, но в анаэробных условиях могут бродить, однако значительно менее интенсивно, чем виды из предыдущей группы. Это аскомицетовые дрожжи из родов Pichia, Debaryomyces, а также все способные к брожению базидиомицетовые дрожжи.
4. Дрожжи, существующие только за счет дыхания и не способные расти в анаэробных условиях. К этой группе относятся аскомицетовые дрожжи из рода Lipomyces и многие несовершенные дрожжи базидиомицетового аффинитета - Cryptococcus, Rhodotorula, Sporo-bolomyces.
При росте в анаэробных условиях дрожжи превращают глюкозу в пировиноградную кислоту по гликолитическому пути, получая 2 моля АТФ на 1 моль глюкозы. Процесс гликолиза включает реакцию окисления фосфоглицеринового альдегида, в которой образуется восстановленный пиридиннуклеотид НАДН. В аэробных условиях последний окисляется через систему переноса электронов кислородом. В отсутствие же кислорода для сохранения окислительно-восстановительного равновесия необходимо окислить НАДН каким-либо другим путем.
В дрожжевой клетке это окисление включает декарбоксилирование пирувата и превращение образовавшегося при этом ацетальдегида в этанол с одновременным окислением НАДН до НАД+. Образовавшийся НАД+ может принимать участие в окислении следующей молекулы фосфоглицеринового альдегида (рисунок 7).
Ход брожения может сильно меняться в зависимости от условий. Если, например, в культуру бродящих дрожжей добавить бисульфит, то образующийся из пирувата ацетальдегид связывается в бисульфитный аддукт, тем самым блокируя образование этанола. Дрожжевые клетки в ответ на это используют для окисления накапливающегося НАДН половину образующегося триозофосфата. Последний, восстанавливаясь, превращается в глицерин. Хотя при этом суммарный выход АТФ становится равным нулю и такое брожение не может обеспечить рост клеток, его можно использовать для промышленного получения глицерина.
В типичном же случае основные продукты спиртового брожения - этанол и углекислота, однако в микроколичествах образуется также множество побочных соединений.
Субстраты брожения. Все бродящие дрожжи сбраживают глюкозу и фруктозу, поскольку именно с этих сахаров начинается гликолитическое расщепление.
Кроме глюкозы и фруктозы могут сбраживаться другие соединения, которые легко превращаются в интермедиаты гликолитического пути. В основном к ним относятся гексозы и олигосахариды, включающие остатки гексоз.
Из моносахаридов наиболее часто сбраживается галактоза, из дисахаридов - сахароза, мальтоза, трегалоза. Значительно реже встречаются дрожжи, сбраживающие лактозу и мелибиозу.
|
|
Рисунок 7 – Пути катаболизма различных соединений дрожжами
Долгое время не были известны дрожжи, способные интенсивно сбраживать пентозы. Такие виды были описаны только к началу
80-х гг. XX века. К ним относятся Pichia stipitis (несовершенная стадия - Candida shehatae), Pachysolen tannophilus.
Брожение ксилозы начинается с восстановления ее до ксилита с помощью фермента ксилозоредуктазы. Затем ксилит окисляется ксилитдегидрогеназой до ксилулозы, которая фосфорилируется с образованием ксилулозо-5-фосфата. Последний может вступать в реакции пентозофосфатного пути, где происходит перестройка углеродного скелета ксилулозо-5-фосфата с образованием интермедиатов гликолиза (см. рисунок 7).
2.5.3 Дыхание
При росте в аэробных условиях при низком содержании глюкозы в среде дрожжи получают АТФ за счет процессов дыхания, как это делает большинство аэробных организмов. Полное окисление углеродного субстрата до углекислого газа и воды может происходить у дрожжей с помощью трех различных механизмов: в цикле трикарбоновых кислот, в глиоксилатном цикле и в пентозофосфатном цикле (см. рисунок 6). При функционировании каждого из этих циклов в клетке происходит образование восстановленных пиридиннуклеотидов. Они могут быть использованы либо для процессов восстановления в ходе биосинтеза, либо для получения АТФ путем окислительного фосфорилирования. В последнем случае НАДН становится донором электронов для электронно-транспортной цепи, в которую у дрожжей входят такие белки-переносчики электронов, как флавопротеиды, убихиноны и цитохромы, локализованные на внутренней мембране митохондрий.
Спектр углеродных соединений, усваиваемых дрожжами за счет аэробного дыхания, значительно шире, чем в случае брожения. К ним относятся углеводы, жирные кислоты, н-алканы, одноуглеродные соединения (метанол), ароматические соединения (фенол, резорцин, салициловая кислота и т. п.).
2.5.4 Источники азота
Универсальным источником азота для дрожжей являются соли аммония. Аммонийный ион, а также аммиак усваиваются всеми без исключения видами дрожжей.
Азот аммония включается в метаболизм с помощью реакций аминирования - взаимодействия NH3 с a-кето-кислотами:
a-Кетоглутарат + NH3 + НАДН + Н+ ® Глютамат + НАД+ + Н2О.
Многие дрожжи способны усваивать азот в окисленной форме - в виде солей нитратов и нитритов. Дрожжи, использующие нитраты, имеют две ферментные системы: первая восстанавливает нитрат до нитрита, вторая - нитрат до аммония. У некоторых видов присутствует только вторая ферментная система - они способны усваивать нитриты, но не нитраты. Способность к ассимиляции нитратов считается ценным таксономическим признаком, поэтому определение способности к росту на среде с KNO3 в качестве единственного источника азота - рутинный тест при идентификации дрожжей. В последнее время, с развитием геносистематики, тесту на ассимиляцию нитратов стали придавать меньшее значение как диагностическому признаку.
Источниками азота для дрожжей могут быть также различные органические соединения, содержащие NH-группы: амины, аминокислоты, азотсодержащие гетероциклические соединения. Высвобождение NH3 из таких соединений может идти различными путями. Первый - окисление аминооксидазами. Второй путь - переаминирование - перенос NH-группы с ассимилируемого субстрата на a-кетокислоту с образованием соответствующей аминокислоты.
Практически все дрожжи используют в качестве источника азота мочевину, расщепляя ее на СО2 и NH3. Однако механизм этого расщепления различен у аскомицетовых и базидиомицетовых дрожжей. Аскомицетовые дрожжи сначала карбоксилируют мочевину с образованием аллофоната, который затем гидролизуется:
Базидиомицетовые дрожжи непосредственно расщепляют мочевину с помощью фермента уреазы. В этом случае аммиак образуется в избытке и выделяется в среду:
Это дает возможность различать дрожжи аско - и базидиомицето-вого аффинитета с помощью теста на наличие уреазы: в питательную среду добавляют мочевину и кислотно-основной индикатор (феноловый красный). При наличии уреазы выделяется аммиак, среда подщелачивается и индикатор меняет окраску. Этот простой тест широко используется при видовой идентификации дрожжевых грибов.
2.6 Продукты метаболизма
2.6.1 Общая характеристика
В процессе роста дрожжи образуют множество первичных и вторичных метаболитов, имеющих практическую ценность. Основными продуктами являются эргостерин, этанол и СО2, другие синтезируются как побочные соединения при катаболизме углеводов, обмене аминокислот и пр. Хотя эти соединения обычно накапливаются в культуральной среде в очень незначительных количествах и трудно идентифицируются, они могут иметь большое практическое значение, например, для пищевой промышленности, так как от их состава зависит качество пищевого продукта, получаемого с помощью дрожжей. Такие соединения называют органолептическими.
Обязательные побочные продукты метаболизма дрожжей - высшие спирты (сивушные масла). Механизм синтеза высших спиртов связан с образованием алифатических аминокислот (валин, лейцин, изолейцин). Он включает удаление с аминокислот и их предшественников аминогрупп (трансаминирование), образующаяся аминокислота декарбоксилируется и восстанавливается до спирта.
Чаще всего встречаются спирты: пропиловый, изоамиловый, бутиловый, изобутиловый. Летучие жирные кислоты, такие как уксусная, пропионовая, масляная, изомасляная, изовалериановая - обычные минорные продукты метаболизма дрожжей. Большое практическое значение имеют выделяемые дрожжами альдегиды и кетоны, особенно ацетоин и диацетил:
|
|
Исходным соединением для синтеза ацетоина и диацетила является пируват. При декарбоксилировании пирувата образуется ацетальдегид, который конденсируется с другой молекулой пирувата с образованием ацетомолочной кислоты. Декарбоксилирование ацетолактата дает ацетоин, обратимо окисляющийся до диацетила. С ацетолактата начинается также путь биосинтеза валина и пантотеновой кислоты, поэтому ацетоин и диацетил считают побочными продуктами синтеза этих соединений. Эти и другие соединения сильно влияют на вкус спиртных напитков - вина и пива.
Среди других побочных продуктов большое значение имеют также длинноцепочечные жирные кислоты, эфиры и меркаптаны.
2.7 Лимитирующие факторы
За исключением нескольких холодолюбивых видов, среди дрожжей нет ярко выраженных экстремофилов, то есть видов, предпочитающих крайне высокие или низкие значения температуры, рН, осмотического давления, влажности среды и т. п. (рисунок 7).
Рисунок 7 – Относительное количество видов дрожжей
с различной максимальной температурой роста
В то же время существуют дрожжи, которые сильно выделяются среди большинства других видов по своей способности переносить неблагоприятные факторы среды.
2.7.1 Температура
У большинства видов дрожжей минимальная температура роста находится в пределах от 0 до 5 °С, а максимальная от 30 до 40 °С. Почти все дрожжи могут расти при комнатной температуре от 20 до 25 °С. Базидиомицетовые дрожжи в целом характеризуются более низкими максимальными температурами роста, чем аскомицетовые (см. рисунок 7).
В целом дрожжи - это довольно холодолюбивая группа микроорганизмов. Часто это дает возможность создать селективные условия при выделении дрожжей из различных субстратов. Дело в том, что учету и выделению дрожжей методом посева на твердых питательных средах сильно мешают мицелиальные грибы, присутствующие в изучаемом субстрате. Колонии грибов маскируют более мелкие дрожжевые колонии и затрудняют их изоляцию. Подобрать какую-либо селективную только на одноклеточные грибы питательную среду, то есть ограничить рост мицелиальных грибов химически невозможно: все ингибиторы роста мицелиальных грибов действуют и на дрожжи. Однако при выращивании посевов при низкой (около 5 °С) температуре дрожжевые колонии в среднем развиваются быстрее. Это дает возможность частично избавиться от колоний мицелиальных грибов.
2.7.2 Активность воды
Активность воды (aw) в каком-либо растворе определяется как отношение давления пара над раствором к давлению пара над чистой водой. Для чистой воды aw =1. Все без исключения дрожжи способны расти при aw, приближающейся к 1. Большинство видов дрожжей перестает расти при aw = 0,9. Такую активность воды имеет, например, 50%-ный раствор глюкозы или 14%-ный раствор NaCl. Однако ряд видов дрожжей способен развиваться при концентрации глюкозы в среде до 60 % или при концентрации NaCl до 20%. Такие дрожжи называют ксеротолерантными. К ним относятся аскомицетовые дрожжи Zygo-saccharomyces bailii, Zygosaccharomyces rouxii, Schizosaccharomyces pombe, Debaryomyces hansenii и др. Эти виды часто встречаются в различных вареньях, джемах, сиропах, сухофруктах и могут вызывать порчу этих продуктов. Дрожжи Debaryomyces hansenii особенно устойчивы к высокой концентрации NaCl в среде и часто встречаются в различных соленьях, на консервированных мясных продуктах, в морской воде.
Механизм устойчивости ксеротолерантных дрожжей к низким значениям aw заключается в изменении внутриклеточной среды. Клетки этих дрожжей способны накапливать различные полиолы, такие как глицерин, арабит, эритрит, ксилит, которые могут служить растворителями для внутриклеточных ферментов. Ксеротолерантные дрожжи могут быть использованы для промышленного получения таких полиолов, которые представляют интерес для химической (глицерин) и пищевой (ксилит) промышленности.
2.7.3 Кислотность среды
Оптимальные значения рН для роста большинства дрожжевых грибов находятся в области средней кислотности (рН 4-6). Однако отдельные виды способны развиваться в более кислой среде. Например, некоторые штаммы Saccharomyces cerevisiae хорошо растут при рН 2,5-3,0. К кислотоустойчивым дрожжам относится также обитающий в кишечном тракте животных Cyniclomyces guttulatus, растущий при рН 2. Дрожжи, которые могли бы расти при щелочных значениях рН (8 и более) не известны.
Практически все виды дрожжей могут расти в диапазоне рН от 4,0 до 4,5. В то же время в такой слабокислой среде не растет большинство банальных бактерий, которые наиболее обычны в самых разных природных местообитаниях (например, псевдомонады, бациллы, коринеподобные бактерии, актиномицеты). На этом основан простейший метод селективного выделения дрожжей: питательная среда (например, сусло-агар) подкисляется НС1 или молочной кислотой до рН 4,0-4,5. В большинстве случаев на такой среде вырастают только дрожжи и быстрорастущие мицелиальные грибы.
2.7.4 Ингибиторы роста
Рост дрожжей подавляется многими антибиотиками актиномицетного и грибного происхождения с разным механизмом действия. Наиболее известны из них следующие (рисунок 9).
Циклогексимид (актидион) подавляет синтез цитоплазматического белка на полирибосомном уровне. Чувствительность к этому антибиотику у разных дрожжей сильно варьирует, и признак устойчивости к нему используется в таксономии дрожжей для дифференциации видов. Например, Saccharomyces cerevisiae и родственные виды полностью ингибируются при концентрации циклогексимида всего несколько миллиграмм на литр, большинство видов Khuyveromyces, апикулятные дрожжи Kloeckera-Hanseniaspora резистентны к этому соединению и могут расти при его концентрации до 100 мг/л.
Хлорамфеникол ингибирует синтез митохондриальных белков, но не оказывает действия на белковый синтез в цитоплазме.
Высокая концентрация глюкозы обеспечивает рост Saccharomyces cerevisiae в присутствии хлорамфеникола за счет брожения, но при снижении концентрации глюкозы рост прекращается, так как образовавшийся ацетил-КоА не включается в метаболизм из-за неспособности дрожжей синтезировать ферменты цикла Кребса в митохондриях.
Туникамицин селективно блокирует синтез и секрецию маннан-протеинового комплекса клеточной стенки и маннансодержащих ферментов (инвертазы, фосфатазы). Рост Saccharomyces cerevisiae подавляется слабо, но клетки становятся очень чувствительными к действию литических ферментов.
Рисунок 9 – Примеры наиболее известных антимикотиков,
ингибирующих рост дрожжей
В качестве эффективных ингибиторов роста грибов хорошо известны полиеновые антибиотики, состоящие из циклической липофильной и более подвижной гидрофильной частей. Они подавляют рост грибов и дрожжей, но не прокариот. Действие их проявляется в образовании прочного комплекса с цитоплазматической мембраной, что приводит к изменению ее проницаемости и вытеканию многих цитоплазматических компонентов. Приобретение устойчивости к полиеновым антибиотикам сопровождается изменениями в составе стеринов и жирных кислот. Наиболее известные примеры полиеновых антибиотиков - нистатин, амфотерицин. Сходное действие оказывают некоторые соединения из группы азолов, например флуконазол. Эти соединения широко используются при лечении заболеваний, вызываемых некоторыми видами дрожжей, таких как кандидоз и криптококкоз.
Киллерный эффект у дрожжей был впервые обнаружен у Saccharomyces cerevisiae Макоуром и Беваном в 1963 г. Киллерные дрожжи выделяют токсин, к которому они сами устойчивы, но который летален для других - чувствительных штаммов. Киллерные штаммы были обнаружены сначала у дрожжей из родов Saccharomyces, Candida, Debaryomyces, Kluyveromyces, Pichia, а позже у базидиомицеговых дрожжей и их анаморф.
Для определения киллерной активности штамм дрожжей высевается штрихом на поверхность твердой питательной среды, на которую (или в которую) нанесен газон чувствительного штамма. Штамм считается киллерным, если штрих оказывается окруженным чистой зоной, в которой отсутствует рост чувствительного штамма, то есть принцип метода тот же, что и при определении антибиотической активности.
Генетические анализы киллер-эффекта у лабораторных штаммов Saccharomyces cerevisiae показали, что расщепление по этому признаку отличается от менделевского. Более того, для передачи киллерного признака достаточно одного процесса плазмогамии без слияния ядер. Это указывает на то, что киллерный фенотип кодируется внеядерными генетическими элементами (плазмидами). Анализ бесклеточных экстрактов киллерных дрожжей на присутствие плазмид, ответственных за киллерный эффект, обнаружил два типа двунитевой РНК (днРНК): более тяжелая была обозначена L, более легкая - М.
Далее было показано, что именно М днРНК определяет киллерный фенотип: у некиллерных штаммов М днРНК отсутствует, киллерные штаммы после инкубации при повышенных температурах или обработки циклогексимидом теряют и М днРНК, и киллерную активность. Однако для экспрессии киллерного фенотипа необходимо присутствие как М, так и L днРНК: последняя необходима для поддержания первой. Дело в том, что как М, так и L днРНК окружены белковой оболочкой, то есть представляют собой вирусоподобные частицы (ВПЧ). Если М днРНК ответственна за образование киллерного токсина, то L днРНК кодирует капсидный белок для обоих типов частиц. Так как ВПЧ не проявляют логического цикла, их относят к латентным вирусам. Такие вирусы найдены у многих грибов.
Только у одного штамма другого вида дрожжей - Kluyveromyces lactis (штамм IFO 1267) - были найдены киллерные плазмиды совершенно другого типа, относящиеся к ДНК-плазмидам. Все остальные изученные киллерные штаммы дрожжей Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Kluyveromyces, Pichia не обнаруживали никаких плазмид. Киллерная активность наследуется у них менделевским путем, ингибируется циклогексимидом, то есть кодируется ядерными генами.
Киллерные токсины всех изученных дрожжей представляют собой пептиды или гликопептиды. Лучше других изучен токсин из Saccharomyces cerevisiae. Он состоит из двух полипептидных компонентов: a и b, которые связаны дисульфидными связями.
Киллерные токсины секретируются в экспоненциальной фазе. Сначала в клетке образуется протоксин, который гликозилируется для эффективного транспорта. Затем гликозилированный токсин переносится в систему Гольджи и включается в секреторные везикулы. В системе Гольджи происходит расщепление протоксина на a - и b-компо-ненты, которые соединяются дисульфидными связями. Это приводит к активированию токсина, который секретируется при слиянии везикул с цитоплазматической мембраной. Третий - g-компонент протоксина (сайт гликозилирования) - остается в мембране и обусловливает иммунность к секретируемому токсину.
Механизм действия киллерного токсина заключается в связывании его клеточной стенкой чувствительного штамма. Рецептором является b (1®6)-глюкан. Сферопласты дрожжей, однако, чувствительны к киллерному токсину, то есть существует также и второй рецептор в мембране. Токсин повреждает цитоплазматическую мембрану путем образования пор, что приводит к свободному прохождению ионов через мембрану, а значит к дисбалансу в ионном составе клетки и блокировке работы протонного насоса. Таким образом, последовательность событий при действии киллерного токсина на клетку такова: связывание токсина с b-глюканом - связывание с рецептором на мембране - образование пор - изменение электрохимического потенциала клетки из-за утечки ионов калия - гибель клетки.
Киллерные дрожжи интенсивно изучаются в последнее время в связи с перспективами их практического использования. В бродильной промышленности, при приготовлении вина, пива, часто происходит заражение бродящего сусла так называемыми «дикими» дрожжами, которые изменяют ход брожения в нежелательную сторону. Использование киллерных штаммов Saccharomyces cerevisiae для сбраживания исключает развитие диких дрожжей - киллерный токсин будет попросту подавлять их рост. Сходные проблемы возникают во всех других видах дрожжевых производств, где используются чистые культуры. Применение киллерных токсинов дрожжей перспективно также в медицине в качестве противодрожжевых и противогрибных антибиотиков.
Киллерные токсины обладают избирательным, видоспецифическим действием, поэтому определение устойчивости или чувствительности к различным токсинам используется в систематике дрожжей в качестве важного таксономического признака при дифференциации видов.
3 Промышленное использование дрожжей
3.1 История использования
Дрожжи были первыми микроорганизмами, которые человек стал использовать для удовлетворения своих потребностей. Основное свойство дрожжей, которое всегда было привлекательным для человека - это способность к образованию довольно больших количеств спирта из сахара. Первое упоминание о получении спиртных напитков в Египте, так называемой «бузы», представляющей собой разновидность пива, относится к 6000 г. до н. э. Этот напиток получали в результате сбраживания пасты, полученной при раздавливании и растирании проросшего ячменя. Приготовление «бузы» можно считать рождением современного пивоварения. Из Египта технология пивоварения была завезена в Грецию, а оттуда в Древний Рим. В этих же странах активно развивалось виноделие. Крепкие спиртные напитки, полученные перегонкой бражки, по-видимому, были впервые получены в Китае около
1000 г. до н. э.
В Европу процесс производства спирта был завезен позже. Известно, что получение виски было налажено в Ирландии в XII веке. Сейчас промышленное производство спиртных напитков существует в большинстве стран мира и представляет собой крупную отрасль промышленности.
Другая группа процессов, в которых издавна используются дрожжи, также связана с их способностью к спиртовому брожению: образование углекислого газа под действием дрожжей - важнейший этап в приготовлении хлеба, приводящий к заквашиванию теста. Этот процесс также очень древний. Уже к 1200 г. до н. э. в Египте была хорошо известна разница между хлебом из кислого и пресного теста, а также польза от применения вчерашнего теста для заквашивания свежего.
3.2 Традиционные процессы
Виноделие, пивоварение и хлебопечение существуют уже несколько тысячелетий. Естественно, что за это время были селекционированы сотни видов заквасок, которые используются для приготовления самых различных сортов вина и пива. Но лишь в начале XIX века были высказаны предположения, что за спиртовое брожение, вызываемое этими заквасками, ответственны присутствующие в них дрожжи, увиденные впервые в 1680 г. Антони ван Левенгуком. Эти дрожжи были описаны в 1837 г. Мейером, который дал им название Saccharomyces. Окончательным доказательством роли дрожжей в сбраживании сахаров считается работа Пастера, опубликованная им в 1866 г. К концу XIX века стало известно, что сахаромицеты, выделенные из различных заквасок и различных сортов вина и пива, различаются по физиологическим свойствам, например, по способности к сбраживанию различных сахаров. В дальнейшем на основании таких физиологических различий в роде Saccharomyces было описано несколько десятков видов. Однако в последние годы методами молекулярной и генетической таксономии было показано, что большинство этих «видов» на самом деле представляют собой различные физиологические расы нескольких близких биологических видов, главным образом Saccharomyces cerevisiae. Это такие виды, как, например, Saccharomyces vini, S. ellipsoides, S. oviformis, S. cheresiensis, S. chevalieri и десятки других, которые сейчас переведены в разряд синонимов S. cerevisiae. Большинство этих видов - это селекционированные веками расы, то есть такой же продукт человеческой деятельности, как сорта культурных растений.
В природе их найти иногда просто невозможно. Однако недавно
обнаружил, что на Дальнем Востоке распространены дикие популяции S. cerevisiae в сокотечениях дуба. Он предположил, что Дальний Восток - центр распространения этих дрожжей. Кроме Saccharomyces cerevisiae среди дрожжей, используемых в виноделии и пивоварении, выделяют еще три очень близких вида: S. bayanus,
S. раradoxus и S. pastorianus и их межвидовые гибриды.
Кроме вина и пива, ставших наиболее популярными, в мире производится множество разнообразных традиционных алкогольных напитков: сакэ на Востоке, пульке и текила в Южной Америке, помбе в Африке и т. д. Они различаются по типу исходного сырья, способам осахаривания полисахаридов, видам добавок. В некоторых случаях для сбраживания используются виды дрожжей, отличные от S. cerevisiae. При производстве рома, например, применяются дрожжи из рода Schizosaccharomyces.
На протяжении нескольких тысяч лет человечество совершенствовало технологию изготовления вина, пива и хлеба, доводя ее до уровня искусства и получая все более изысканные продукты. Новый этап в развитии бродильных процессов начался после работ Пастера, Коха и других корифеев микробиологии, которые ввели в практику метод чистых культур. Тем не менее до конца XIX века дрожжи применялись лишь в виноделии, пивоварении и хлебопечении. Двадцатый век, с его безудержным развитием промышленности, резко расширил и области применения дрожжей. Они стали выращиваться в больших масштабах в качестве источника белка и витаминов для сельскохозяйственных животных. Дрожжи - основной источник технического этанола. С помощью дрожжей сейчас получают большой спектр соединений, использующихся в разных областях человеческой деятельности.
К ним относятся витамины, различные полисахариды, липиды, которые могут служить заменителями растительных масел, разнообразные ферменты, используемые в пищевой промышленности. Развитие генетической инженерии позволило использовать легко культивируемые дрожжи для получения многих полезных веществ животной и растительной природы, например инсулина.
3.3 Виноделие
В основе получения вина лежит сбраживание фруктозы и глюкозы виноградного сока с образованием этилового спирта. Собранный виноград давят и получают так называемое виноградное сусло, или муст, в котором содержится от 10 % до 25 % сахара. При производстве красного вина кожица и косточки винограда остаются в соке в течение всего процесса брожения, тогда как для приготовления белых вин их удаляют после раздавливания ягод, и сбраживается только сок. В традиционных процессах приготовления вина сбраживание муста ведется с помощью дрожжей, присутствующих на винограде. При этом в брожении участвует множество видов дрожжей, сменяющих друг друга, таких как Hanseniaspora, Brettanomyces, Saccharomyces. В современном виноделии для сбраживания в основном используют чистые культуры специальных рас сахаромицетов. При этом «дикие» дрожжи сначала убивают, пропуская через муст двуокись серы. После окончания брожения молодое вино необходимо осветлить и дать ему созреть. Эти процессы для высококачественных вин могут занимать несколько лет. В процессе созревания вина происходят различные биохимические изменения, которые улучшают вкусовые качества вина, и рост бактерий, которые удаляют из него яблочную кислоту.
При производстве некоторых сортов вин в качестве исходного сырья используется не виноградный сок, а уже готовое вино. Такое так называемое вторичное виноделие включает процессы дображивания и модификации вин с использованием специальных рас дрожжей. К наиболее известным продуктам вторичного виноделия относятся шампанские вина. Шампанское получают из смеси вин (купажа), в которую добавляют сахар и дрожжи, после чего выдерживают в замкнутом объеме для вторичного брожения (шампанизации). Традиционные процессы шампанизации проводятся в бутылках, на крупных заводах -
в больших емкостях. При шампанизации происходит растворение и химическое связывание образующейся углекислоты, которая при открывании бутылки в результате перепада давления освобождается и придает вину неповторимую игристость.
Дрожжи вносят в производство вина двойной вклад: они ответственны за образование этанола в напитке, а также за накопление в нем множества соединений, от которых зависит его вкус и аромат. Такие соединения называются органолептическими. Часть из них образуется непосредственно в ходе брожения, часть - при химических превращениях компонентов вина в ходе его созревания. В винах обнаружены сотни органолептических соединений. Многие из них присутствуют в очень малых количествах и с трудом поддаются идентификации. Еще сложнее определить вклад всех этих соединений в окончательный букет вина, поскольку для каждого вещества характерна своя концентрация, при которой его присутствие можно уловить с помощью обоняния (так называемый порог запаха).
3.4 Пивоварение
Пиво - слабоалкогольный напиток, который получают путем сбраживания охмеленного сусла специальными расами дрожжей. Вкус и аромат его создают экстрактивные вещества, извлеченные из солода, горькие и ароматические вещества хмеля, а также этиловый спирт, углекислый газ и другие продукты брожения. Сортовые различия пива определяются типом используемого солода, количеством и видом добавляемых неосоложенных продуктов.
Процесс производства пива включает ряд стадий: изготовление солода из ячменя, получение охмеленного сусла, сбраживание сусла, дображивание и созревание молодого пива, фильтрацию и розлив.
Пиво производят из зерна, которое в отличие от винограда содержит в основном крахмал, плохо усваиваемый дрожжами. Поэтому перед сбраживанием этот крахмал необходимо осахарить (гидролизовать). Традиционно в различных странах для производства пива использовали различные виды зерновых: в Европе - ячмень, в Азии - рис, в Америке - кукурузу. При осахаривании ячменя обычно пользуются амилазами самого ячменя, которые образуются в большом количестве при прорастании зерна. Для гидролиза рисового крахмала на Востоке традиционно используют некоторые штаммы мицелиальных грибов (Мисог, Aspergillus). Проросший и высушенный ячмень (солод) затем высушивают в печи. При этом в результате карамелизации сахаров образуются окрашенные соединения, которые придают пиву характерный цвет. Высушенный солод размалывают, смешивают с водой и варят, в результате чего получается так называемое пивное сусло. В результате всех этих процессов часть крахмала исходного зерна гидролизуется до мальтозы, глюкозы и других сахаров, другая часть, фракция декстринов, не расщепляется и поэтому не утилизируется дрожжами и остается без изменений в течение всего последующего процесса брожения. Концентрация декстринов обусловливает плотность пива (светлое или темное). После осахаривания зерно высушивают, размалывают, кипятят, фильтруют, и полученное пивное сусло сбраживают чистыми культурами дрожжей S. cerevisiae.
Пивные дрожжи, используемые в пивоваренной промышленности, обладают высокой флокуляционной способностью, медленно и полно оседают при осветлении молодого пива в конце главного брожения и готового - в конце дображивания. Они активно сбраживают глюкозу и фруктозу, медленнее - мальтозу и еще медленнее - трисахарид мальтотриозу. Декстрины не сбраживаются и играют важную роль в создании полноты и вкуса пива. Пивные дрожжи в незначительном количестве накапливают высшие спирты, диацетил и сернистые соединения, а также обеспечивают насыщенность пива углекислотой. В настоящее время в России в пивоваренной промышленности применяют главным образом дрожжи Sacch. cerevisiae низового брожения (наиболее широко используют расы 776, 41, 44, S-Львовская, 11, 8а (М), а также расы Р и F).
При производстве пива могут развиваться посторонние виды дрожжей. Они ухудшают процесс брожения и осветления пива, вызывают его помутнение, придают посторонний вкус и запах. Описано около 30 видов «диких» дрожжей, инфицирующих пиво. Однако детальное изучение свойств многих из них показало, что многочисленные «виды» в большинстве случаев являются мутантами культурных дрожжей. В настоящее время предложено рассматривать такие «виды», как синонимы Sacch. cerevisiae.
В пивоварении различают два типа брожения: верховое (теплое) и низовое (холодное). Вызывающие их дрожжи различаются рядом свойств и ранее рассматривались как различные виды: верховые S. cerevisiae и низовые S. carlsbergensis. Дрожжи низового брожения функционируют при температуре от 6 до 10 °С, в то время как верховое брожение протекает при 14-25 °С. Для максимального превращения сахара в этанол необходимо, чтобы дрожжи оставались суспендированными в бродящей жидкости. С другой стороны, флоккуляция дрожжей после того, как брожение закончилось или достигло желаемой стадии, очень облегчает удаление дрожжей из напитка. Другими словами, дрожжи должны флоккулировать только на определенной стадии брожения. Хотя важность процесса флоккуляции в изготовлении алкогольных напитков была оценена уже более ста лет назад, физиологический механизм этого явления был изучен лишь в последние десятилетия. В слипании клеток участвуют присутствующие в растворе ионы двухвалентного кальция, взаимодействующие с карбоксильными и фосфодиэфирными группами на поверхности клеточных стенок дрожжей.
3.5 Хлебопечение
Производство хлеба включает сложный цикл микробиологических и биохимических процессов, происходящих в тесте с момента смешивания муки с водой и заканчивающихся выпечкой. В сортах муки, используемой для выпечки пшеничного и ржаного хлеба, входят компоненты, необходимые для развития многих микроорганизмов. Кроме крахмала в муке содержится до 0,7-1,8 % (в пересчете на сухое вещество) сбраживаемых сахаров - глюкозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, раффинозы, существенно влияющих на первые стадии брожения теста. Образующиеся при гидролизе крахмала амилолитическими ферментами муки углеводы (мальтоза и др.) - основные субстраты, обеспечивающие процесс брожения и хорошее газообразование при изготовлении теста. Азотсодержащие вещества муки состоят главным образом из белков. В незначительном количестве содержатся и небелковые азотистые вещества - свободные аминокислоты и амиды. Кроме того, протеиназы муки обогащают тесто водорастворимыми азотсодержащими соединениями. В состав муки входит до 2 % минеральных веществ, в том числе микроэлементы.
Мука всегда содержит значительное количество различных микроорганизмов. Вносятся они и с добавками к тесту. Важнейшую роль в брожении теста играют дрожжи и молочнокислые бактерии, для которых имеются все необходимые условия: влажность 40-50 %, незначительное содержание молекулярного кислорода и наличие питательных веществ. Микробиологические процессы и связанные с ними биохимические изменения в тесте определяют пористость, окраску, прочность среза и сохранение свежести хлеба, придают ему вкус и аромат.
Все дрожжи, которые используются в хлебопечении, относятся к виду Saccharomyces cerevisiae и исторически происходят от штаммов пивных дрожжей. Мука обычно почти не содержит свободных сахаров, которые могут сбраживаться дрожжами. В низкосортной муке могут присутствовать ферменты, расщепляющие крахмал, однако в высокоочищенных сортах муки эти ферменты разрушены, и для заквашивания теста в муку приходится добавлять сахар. При брожении происходит интенсивное выделение СО2, которая задерживается в тесте, заставляя его подниматься. Образующийся спирт удаляется в процессе выпечки.
Раньше дрожжи для хлебопечения получали с пивоварен. В конце XIX века развилась целая отрасль по производству прессованных или сухих пекарских дрожжей. Современное производство пекарских дрожжей имеет ряд существенных особенностей по сравнению с бродильной промышленностью. Основная цель такого производства - получение дрожжей, которые с высокой скоростью вырабатывают в тесте углекислый газ за счет брожения в анаэробных условиях. Однако производить их надо при хорошей аэрации, чтобы добиться большего выхода дрожжевой биомассы (эффект Пастера). Полученные дрожжи должны не только обладать высокой бродильной активностью в тесте, но и хорошо храниться, не теряя своих качеств в замороженном или высушенном состоянии. Пекарские дрожжи выращивают в больших сосудах при интенсивном перемешивании и аэрации. При этом питательная среда, основой которой обычно служит меласса, подается постепенно или порциями. Если добавить сразу много сахара, то метаболизм дрожжей переключится на бродильный (эффект Кребтри), и выход биомассы уменьшится. По завершении роста дрожжи концентрируют центрифугированием и фильтруют. Образующийся на фильтре осадок можно превращать в брикеты прессованных дрожжей. Сухие дрожжи получают высушиванием массы в специальных распылительных сушилках.
При приготовлении теста из пшеничной муки обычно применяют хлебопекарные прессованные дрожжи. Их производят на специализированных дрожжевых заводах; в качестве питательной среды используют мелассу с добавлением необходимых питательных компонентов. Дрожжи после выращивания при аэрации отделяют от питательной среды сепарированием, промывают и прессуют. Влажность их составляет 75 %, поэтому они не могут храниться длительное время.
Для получения хлебопекарных дрожжей используют быстрорастущие расы верхового брожения. Они должны иметь крупные клетки (не менее 7,0´11,0 мкм), хорошо сбраживать сахара при высокой концентрации сухих веществ в тесте, быть солеустойчивыми и устойчивыми к вредным примесям мелассы, иметь высокую скорость генерации (m = 0,2 ч-1), обладать высокой подъемной силой и мальтазной активностью. Подъемная сила отражает активность бродильных ферментов клетки, ее зимазного комплекса, а мальтазная активность свидетельствует о скорости сбраживания мальтозы.
В хлебопечении применяют также сухие дрожжи, которые готовят высушиванием прессованных до влажности 7-10 %. В отечественной промышленности используют разные расы Sacch. cerevisiae. На многих хлебозаводах используют смесь различных рас. На некоторых заводах нашли применение гибридные дрожжи. В настоящее время для приготовления пшеничного и ржаного теста широко используют закваски, состоящие из дрожжей и молочнокислых бактерий.
Ржаное тесто часто готовят на густых заквасках, обеспечивающих его разрыхление и кислотонакопление. Их изготовляют с помощью чистых культур гомо - и гетероферментативных молочнокислых бактерий и дрожжей.
Жидкие закваски - полуфабрикат, при получении которого на осахаренных заварках или жидких водно-мучных смесях при температуре 28-30 °С непрерывно-поточным способом одновременно размножаются мезофильные гетероферментативные молочнокислые бактерии и дрожжи, попавшие туда спонтанно (например, с мукой) или внесенные специально. При использовании жидких заквасок в тесте протекает не только спиртовое, но и активное молочнокислое брожение, при этом рН теста снижается до 4,7-4,8.
Жидкие дрожжи - полуфабрикат, в котором (в отличие от жидкой закваски) основным компонентом, ведущим брожение в тесте, являются микроорганизмы. Для достижения этого осахаренная и охлажденная до 50 °С мучная заварка заквашивается бактериями Lactobacillus delbrueckii (рН 3,7-3,9). На закисшем заторе при 28 °С в другой емкости культивируют дрожжи, используемые для разрыхления теста. В настоящее время более половины пшеничного хлеба (особенно из муки второго сорта) изготавливается на жидких дрожжах, масштабы применения которых возрастают.
Порчу хлебопекарных изделий могут вызывать неосмофильные и осмофильные виды дрожжей. Неосмофильные дрожжи обусловливают три вида порчи. Аспорогенные дрожжи при попадании в тесто могут понизить качество хлеба и придать ему нежелательный запах. Sacch. cerevisiae и другие бродящие дрожжи, заражая хлеб после выпечки, вызывают появление сильного запаха («фруктового», «ацетонового» и др.). Виды дрожжей, образующие гифы, могут давать на поверхности хлеба хорошо видимый рост. На темных сортах хлеба возможно появление белого налета «меловой плесени», порчу чаще всего вызывают Hyphopichia burtonii.
Осмофильные дрожжи (Zygosacch. rouhii, Zygosacch. bisporus) опасны для кондитерских хлебопекарных изделий, при изготовлении которых компоненты с высоким содержанием сахара (джемы, мармелад, фруктовые наливки и др.) могут портиться (забраживать).
3.6 Дрожжи как источник белка
Биомасса дрожжей в современной биотехнологии считается источником белка, сбалансированного по незаменимым аминокислотам. Использование микробной биомассы для обогащения кормов белком и незаменимыми аминокислотами в условиях интенсивного животноводства - одна из важных проблем будущего, так как человечество развивается таким образом, что оно вряд ли сможет обеспечить себя пищей традиционными методами. Выращивание микроорганизмов не зависит от климатических и погодных условий, не требует посевных площадей, поддается автоматизации. Дрожжи - одна из наиболее перспективных групп микроорганизмов для получения белковых кормовых добавок. Содержание белка в клетках некоторых штаммов дрожжей составляет от половины до 2/3 сухой массы, на долю незаменимых аминокислот приходится до 10 % (в белках сои, богатых лизином, его содержится приблизительно 6 %).
Впервые дрожжи стали рассматривать как источник питания в годы первой мировой войны в Германии, где их использовали в качестве добавки при изготовлении колбас. В первой половине XX века возникла новая отрасль промышленности - производство белка одноклеточных организмов. В нашей стране производство кормовых дрожжей было начато в 1930-х гг. Отходы сельского хозяйства, такие как солома, кукурузные кочерыжки, опилки, подвергали гидролизу серной кислотой, полученные гидролизаты нейтрализовали и использовали для выращивания дрожжей. Наиболее привлекательным в этом производстве является использование возобновляемого сырья, особенно древесины, запасы которой в нашей стране пока достаточно велики. В большинстве этих отходов основным компонентом является целлюлоза, и в гидролизатах будет преобладать глюкоза, усваиваемая всеми без исключения видами дрожжей. Поэтому на гидролизатах можно выращивать самые разнообразные дрожжи, удовлетворяющие технологическим требованиям. В гидролизатах древесины присутствует также большое количество ксилозы, поэтому здесь желательно использование видов, утилизирующих пентозы. В то же время транспортировка сырья на гидролизные заводы оказывается дорогостоящей, поэтому в большинстве стран существуют только локальные мелкие производства кормовых дрожжей, что экологически и экономически более выгодно.
Первый в мире крупный завод кормовых дрожжей мощностью 70000 т в год был пущен в 1973 г. в СССР. В качестве сырья на нем использовали выделенные из нефти н-алканы, а продуцентами стали несколько видов дрожжей, способных к быстрому росту на углеводородах: Candida maltosa, Candida guilliermondii, Candida lipolytica.
В дальнейшем именно отходы от переработки нефти служили главным сырьем для производства дрожжевого белка, которое быстро росло и к середине 1980-х гг. превысило 1 млн т в год, причем в СССР кормового белка получали вдвое больше, чем во всех остальных странах мира вместе взятых. Этому способствовала организация научно-исследо-вательской работы. Были подробно изучены специфические особенности окисления и ассимиляции углеводородов, кинетические параметры роста, разработана технология их культивирования в крупных ферментерах объемом в сотни кубических метров. Однако в последующем масштабы производства дрожжевого белка на углеводородах нефти резко сократились. Это произошло как в результате экономического кризиса 1990-х гг., так и из-за целого ряда специфических проблем, с которыми связано это производство. Одна из них - необходимость очистки готового кормового продукта от остатков нефти, имеющих канцерогенные свойства.
Другим пригодным видом сырья для производства микробного белка является метанол. На метаноле как на единственном источнике углерода и энергии способны расти около 25 видов дрожжей, в том числе Pichia polymorpha, Pichia anomala, Yarrowia lipolytica. Однако более выгодным считается выращивание на метаноле метилотрофных бактерий, таких как Methylophilus methylotrophus, так как они используют одноуглеродные соединения более эффективно. Поэтому при росте на метаноле бактерии дают больше биомассы, чем дрожжи. Первая реакция окисления метанола у дрожжей катализируется оксидазой, а у метилотрофных прокариот - дегидрогеназой. Ведутся генноинженерные работы по переносу гена метанолдегидрогеназы из бактерий в дрожжи. Это позволит объединить технологические преимущества дрожжей с эффективностью роста бактерий.
В последнее время интенсивно изучаются дрожжи, обладающие гидролитическими ферментами и способные расти на полисахаридах без их предварительного гидролиза. Использование таких дрожжей позволит избежать дорогостоящую стадию гидролиза полисахаридсодержащих отходов. Известно более 100 видов дрожжей, которые хорошо растут на крахмале как на единственном источнике углерода. Среди них особенно выделяются два вида, которые образуют как глюкоамилазы, так и a-амилазы, растут на крахмале с высоким экономическим коэффициентом и могут не только ассимилировать, но и сбраживать крахмал: Schwanniomyces occidentalis и Saccharomycopsis fibuliger. Оба вида - перспективные продуценты белка и амилолитических ферментов на крахмалсодержащих отходах. Ведутся поиски и таких дрожжей, которые могли бы расщеплять нативную целлюлозу. Целлюлазы обнаружены у нескольких видов, например, у Trichosporon pullulans, однако активность этих ферментов низкая, и о промышленном использовании таких дрожжей говорить пока не приходится. Дрожжи из рода Kluyveromyces хорошо растут на инулине, основном запасном веществе в клубнях топинамбура - важной кормовой культуры, которая также может быть использована для получения дрожжевого белка.
Еще один субстрат, пригодный для получения кормового белка, - молочная сыворотка, побочный продукт сыроварения. Молочная сыворотка содержит до 4 % лактозы. Способность к ассимиляции лактозы имеется примерно у 20 % всех известных видов дрожжей. Гораздо реже встречаются дрожжи, сбраживающие лактозу. Активный катаболизм лактозы особенно характерен для дрожжей из рода Kluyveromyces. Эти дрожжи можно использовать для получения на молочной сыворотке кормового белка, этанола, препаратов
b-глюкозидазы.
3.7 Производство этанола
Этанол широко применяется в химической промышленности как исходное соединение для синтеза многих веществ, как растворитель, экстрагент, антифриз и т. п. Вероятно, у этанола большое будущее и как топлива в двигателях внутреннего сгорания: этанол гораздо более экологически чистое топливо, чем бензин.
В принципе этанол можно получать из любого источника углеводов, которые сбраживаются дрожжами. Разнообразие потенциальных продуцентов тоже велико: более 200 видов дрожжей способны сбраживать глюкозу.
Крупномасштабное получение этанола в качестве топлива осуществляется в основном в Бразилии и других странах Южной Америки.
В качестве источника углеводов используется сахарный тростник и маниока, в качестве продуцента этанола - Saccharomyces cerevisiae.
Сырьем для производства спирта служат разнообразные растительные материалы, содержащие в достаточном количестве сбраживаемые сахара или другие углеводы, которые можно осахарить. Наиболее широко используются крахмалосодержащие материалы - зерно (рожь, пшеница, кукуруза, ячмень, овес, просо) и картофель, сахаросодержащие материалы - меласса (отход сахарного и крахмало-паточного производства), дефектная сахарная свекла, а также древесина и отходы сельскохозяйственных растений. Дальнейшее увеличение производства спирта будет идти по пути увеличения мощностей предприятий, использующих непищевое сырье.
Процесс производства спирта из крахмалистого сырья включает ряд стадий. Вначале сырье измельчают и разваривают с целью извлечения и растворения крахмала. Поскольку крахмал не подвержен действию ферментов дрожжей, способных сбраживать только дисахариды и моносахариды, охлажденную разваренную массу обрабатывают амилолитическими ферментами солода (пророщенного зерна) или грибов (Aspergillus oryzae, Asp. niger и др.). Осахаренная масса (затор) содержит смесь углеводов, состоящую из мальтозы, глюкозы и декстринов. Кроме того, в нем имеются пептиды, аминокислоты, фосфорорганические соединения, минеральные соли и микроэлементы.
Следующая стадия - сбраживание осахаренной массы. На спиртовых заводах России применяют периодический и непрерывно-поточный способы брожения. Для этого используют естественно-чистые культуры дрожжей; последние систематически ведут на производственных заторах в специальном дрожжевом отделении. Для подавления в них размножения бактерий пастеризованный и охлажденный до 30 °С затор подкисляют серной кислотой до рН 3,8-4,0. Такие значения рН менее благоприятны для развития дрожжей, чем рН 4,5-5,0, но медленное размножение дрожжей компенсируется возможностью получения практически чистой культуры в нестерильных условиях.
Спиртовые дрожжи, применяемые при переработке крахмалистого сырья, должны обладать высокой бродильной активностью; быстро и полностью сбраживать сахара, а также использовать другие компоненты питательной среды в анаэробных условиях, быть устойчивыми к продуктам своего обмена (особенно к спирту), хорошо противостоять развитию инфекции. Уже около 80 лет применяют Sacch. cerevisiae, раса XII. Эти дрожжи хорошо сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, на 1/3 раффинозу, несколько слабее галактозу. В среде накапливают до 10-11 об. % спирта. Раса XII - верхнебродящая, хорошо распределяется во всем объеме затора, пылевидная, не образует хлопьев. Оптимальная температура ее развития 30-38 °С, максимальная 38 °С, минимальная температура 5 °С. Значение рН во время брожения поддерживают в пределах 3,8-4,0. Используют также другие расы дрожжей, но не так широко. После сбраживания заторов в них остаются неиспользованными около 0,1 % галактозы, 0,4 % декстринов и 0,5 % пентоз.
Проводится селекционная работа по получению рас дрожжей с более высокими производственно ценными свойствами, в частности способных интенсивно использовать галактозу и декстрины. В последние годы большое внимание уделяется селекции термотолерантных рас, дающих в промышленном производстве ряд преимуществ (ускорение микробиологических процессов, уменьшение расхода хладоагента и др.). Разрабатываются методы получения этанола на различных субстратах с использованием иммобилизованных клеток микроорганизмов.
Меласса - побочный продукт сахарного производства (содержит около 80 % сухих веществ и 20 % воды). Сухие вещества представлены сахарами, безазотистыми органическими, азотсодержащими и минеральными веществами. Основной сахар мелассы - сахароза. В сухих веществах ее 45-50 %. Содержится также 0,1-0,5 % инвертного сахара (смесь глюкозы и фруктозы) и 0,5-2 % раффинозы. Все остальные сухие вещества мелассы объединяют общим названием несахара. Они определяют свойства мелассы как сырья для спиртового производства. Азотсодержащие вещества мелассы представлены в основном продуктами распада белковых веществ - аминокислотами и бетаином - органическим основанием, дающим при разложении амины. Содержит она витамины группы В и биотин, необходимые для роста дрожжей. Нормальная доброкачественная меласса имеет слабощелочную или нейтральную реакцию (рН 7,2-8,9).
К дрожжам, используемым для сбраживания мелассных растворов, предъявляются в основном те же требования, что и к расам для производства спирта на крахмалистых средах. Кроме того, они должны обладать способностью переносить высокие концентрации сухих веществ, содержащихся в мелассе, и, возможно, более полно сбраживать рафинозу. Технологические схемы предусматривают использование выделенных после брожения дрожжей в качестве хлебопекарных, поэтому они должны отвечать требованиям, предъявляемым к последним.
В производстве широкое применение нашла раса Я Sacch. cerevisiae, а при использовании дрожжей в качестве хлебопекарных - раса В (венгерская). Дрожжи этих рас хорошо сбраживают сахарозу, глюкозу и фруктозу, рафинозу только на 1/3. При большом содержании раффинозы в мелассе недобор спирта может быть значительным.
Для селекции рас дрожжей с требуемыми свойствами был применен метод гибридизации. В результате скрещивания расы Я с дрожжами, использующимися в пивоваренном производстве и способными образовывать a-галактозидазу, были получены диплоидные гибриды (67 и 73). Они сбраживают раффинозу на 60-70 %, тогда как дрожжи рас Я и В - только на 30 %. В последние годы для сбраживания сусла из свеклосахарной и тростниковой мелассы используют расу V-30. Она сбраживает раффинозу на 2/3, обладает высокой генеративной способностью, а получаемые прессованные хлебопекарные дрожжи лучшего качества, чем дрожжи расы В.
Сырьем для получения технического спирта могут служить гидролизаты древесины и других растительных отходов. Древесина хвойных и лиственных пород содержит 40-75 % полисахаридов. Различают легко - и трудногидролизуемые полисахариды. Легкогидролизуемые полисахариды состоят из гемицеллюлоз и пектиновых веществ. Трудногидролизуемые полисахариды содержат целлюлозу с небольшой примесью гемицеллюлоз.
Растительное сырье под давлением подвергают кислотному гидролизу. Полученный гидролизат содержит 3,2-3,5 % редуцирующих сахаров, преимущественно глюкозу, в небольших количествах галактозу и маннозу, а также пентозы - ксилозу, арабинозу, рамнозу.
Для сбраживания древесных гидролизатов используют ряд рас Sacch. cerevisiae и Schizosaccharomyces. Последние более полно сбраживают галактозу, чем сахаромицеты, и поэтому дают более высокий выход спирта. Брожение проводят по непрерывно-поточному способу при высокой концентрации биомассы (17-25 г/л).
Присутствующие в гидролизате вредные примеси играют роль антисептиков - подавляют развитие посторонних микроорганизмов. Поэтому на гидролизных спиртовых заводах отсутствуют установки для размножения чистых и производственных культур дрожжей, а одни и те же дрожжи используют на протяжении многих месяцев.
Зрелая бражка по окончании брожения, содержит 1,0-1,5 % этанола и побочные продукты брожения, несброженные сахара и другие органические вещества. При перегонке бражки и ректификации гидролизного спирта не удается полностью избавиться от этих примесей; гидролизный спирт (ректификат) содержит до 0,05-0,1 % метанола и несколько большее количество кислот, сложных эфиров и альдегидов, чем ректификат из пищевого сырья.
При традиционном способе получения этанола из гидролизатов древесины и отходов сельскохозяйственных растений значительная часть моносахаридов, в основном ксилозы, остается неиспользованной. В последние годы выявлены дрожжи Pachysolen tannophilus, Candida shehatae (син. Pichia stipitis) и другие, способные сбраживать ксилозу с образованием этанола. Использование таких дрожжей может обеспечить утилизацию до 90 % сахаров, образующихся при гидролизе растительной массы. Разрабатываются промышленные методы производства этанола с применением ксилозосбраживающих дрожжей.
Сульфитные щелока являются отходами целлюлозного производства. Для извлечения целлюлозы древесину обрабатывают при повышенной температуре варочным раствором, обычно представляющим смесь сернистой кислоты с водными растворами бисульфитов и моносульфитов - Ca(HSO3)2, Mg(HSO3)2, NH4HSO3 и NaHSO3. При этом целлюлоза извлекается в неповрежденном виде, а гидролизуются только гемицеллюлозы. Лигнин, входящий в состав древесины, образует с сернистой кислотой водорастворимые лигносульфокислоты. Суммарная концентрация сахаров достигает 3,0-3,5 %, из них 62-68 % сбраживаемые, рН 1,5-1,0.
Сульфитные щелока сбраживают расами Sacch. cerevisiae, которые хорошо используют галактозу, обладают флокулирующими свойствами и сорбируются волокнами целлюлозы. Благодаря наличию в щелоках ряда антисептических веществ нет необходимости в процессе производства размножать дрожжи в специальных аппаратах. Отбродившие дрожжи вновь идут в производство.
Зрелая бражка содержит 0,5-1,0 % этилового спирта и много летучих примесей (альдегиды, эфиры, высшие спирты, метанол, фурфурол, сернистый ангидрид, сероводород). В сульфитном спирте остаются трудноотделяемые сернистые соединения, значительное количество альдегидов и эфиров, а также 2,0-8,0 % метанола. Сульфитный спирт является самым дешевым.
3.8 Различные продукты, получаемые из дрожжей
В последние десятилетия разнообразие биотехнологических процессов, в которых используются дрожжи, резко увеличилось. Еще более разнообразны перспективы использования дрожжей: в различных разработках, патентах и т. п. упоминается более 200 видов. Сейчас дрожжи используются для получения различных ферментных препаратов, органических кислот, полисахаридов, многоатомных спиртов, витаминов и витаминных добавок, а также во множестве других мелкомасштабных процессах.
Промышленно важные органические кислоты, продуцируемые микроорганизмами, являются либо конечными продуктами (молочная, масляная, пропионовая кислоты у анаэробных бактерий), либо интермедиатами метаболизма, которые можно получать с помощью дрожжей. В больших масштабах производится лимонная кислота, в основном с помощью Aspergillus niger, с использованием в качестве субстрата мелассы. Однако ее можно получать и с помощью дрожжей Yarrowia lipolytica на более дешевых субстратах, таких как парафины нефти. Сейчас разработаны технологии получения и многих других кислот, например, изолимонной из Candida catenulata, фумаровой из Candida hydrocarbofumarica, яблочной из Pichia membranaefaciens и др.
Из дрожжевых полисахаридов наиболее популярен пуллулан, который получают из дрожжеподобного гриба Aureobasidium pullulans. Он представляет собой b-глюкан, в котором мальтотриозные остатки соединены между собой b (1®6)-гликозидными связями. Пуллулан используется в основном в пищевой промышленности в качестве пленочного покрытия. Возможно получение разнообразных по строению и свойствам полисахаридов и из других видов дрожжей. Особенно много внеклеточных полисахаридов образуют дрожжи Cryptococcus, Rhodotorula, Lipomyces.
Многоатомные спирты (глицерин, ксилит, эритрит, арабит) широко применяются в химической и пищевой промышленности. Перспективным считается способ получения сахароспиртов, таких как глицерин, эритрит и ксилит, с использованием ксеротолерантных дрожжей Zygosaccharomyces rouxii и Zygosaccharomyces bailii. Эти дрожжи способны расти в средах с высоким осмотическим давлением, синтезируя при этом большое количество внутриклеточных полиолов, которые служат осмопротекторами. Другой способ касается получения ксилита - важного полиола для пищевой промышленности. Ксилит накапливается как побочный продукт при сбраживании ксилозы дрожжами Pachysolen tannophilus. Многие дрожжи служат источниками для получения ферментных препаратов, которые используются в современной пищевой и химической промышленности. Из дрожжевого осадка, образующегося как отход пивоварения, получают фермент
b-фруктофуранозидазу (инвертазу), расщепляющий сахарозу на глюкозу и фруктозу. Препараты инвертазы широко применяются в кондитерской промышленности для предотвращения кристаллизации сахарозы, для приготовления инвертных сиропов. С помощью культур Kluyveromyces marxianus получают b-галактозидазу, которая применяется в молочной промышленности. Дрожжи Yarrowia lipolytica используются для получения лииолитических ферментов, представляющих большой интерес для многих отраслей хозяйства. Липазы используются в сыроварении, в косметической промышленности, при выделке мехов и кож, в моющих средствах. В последние годы разработано множество способов получения самых различных ферментов из дрожжей: пектиназ из Saccharomycopsis fibidiger, амилаз из Schwanniomyces occidentalis, ксиланаз из Cryptococcus laurentii, гидролаз L-a-амино-e-капролактама из криптококков, алкогольоксидазы из Hyphopichia burtonii, оксидазы
D-аминокислот из Trigonopsis variabilis, фенилаланинаммиаклиазы из Rhodotorula glutinis.
Применение дрожжей как источников витаминов началось в 1930-е гг. Одним из первых промышленных процессов получения витаминов было выделение эргостерина из Saccharomyces cerevisiae с последующим облучением ультрафиолетом для перевода в витамин D. Затем у дрожжей была открыта способность к сверхсинтезу некоторых витаминов группы В, в частности рибофлавина. Разработаны промышленные способы получения b-каротина из красных дрожжей. Кроме производства индивидуальных витаминов уже много лет в мире практикуется получение автолизатов и гидролизатов дрожжей, которые используются как источник витаминов и как вкусовые добавки.
3.9 Эргостерин
3.9.1 Общая характеристика эргостерина
Эргостерин является провитамином витамина D. В гг. Ф. Аскью и А. Виндаусу получили в своих лабораториях сначала неочищенный витамин D1, а затем индивидуальный витамин D2 (эргокальциферол) из облученного провитамина - эргостерина. В 1936 г.
Г. Брокман выделил более универсальный природный витамин D3 (холекальциферол) из жира печени тунца. В том же году А. Виндаус получил его фотоизомеризацией провитамина – 7-дегидрохолестерина.
В гг. строение витаминов D2 и D3 было установлено
А. Виндаусом и Дж. Хейлброном и подтверждено в 1957 г. Д. Ходжкином методом рентгеноструктурного анализа. В настоящее время известно еще четыре витамина группы D: D4-D7, но их активность различна.
Эргостерин – эргоста-5,7,22-триен-3b-ол – исходный продукт производства жирорастворимого витамина D2 и кормовых препаратов, обогащенных витамином D2. В группу витаминов D объединяют родственные соединения, важнейшими из которых являются витамины D2 и D3, обладающие антирахитичным действием. Витамин D2 (эргокальциферол) образуется при УФ-облучении эргостерина, витамин D3 (холекальциферол) образуется из 7-дегидрохолестерина. В организме человека и животных эти соединения регулируют усвоение кальция и фосфора из пищи и отложение их в костной ткани.
В основе структуры эргостерина и витамина D лежат четыре углеродных цикла (А, В, С, D). В случае витамина D кольцо В разомкнуто. Углеводородная структура эргостерина и витамина D определяет их липофильные свойства.
Эргостерин Витамин D2
Затем под действием ферментов витамин D2 превращается в
25-гидроксикальциферол:
25-Гидроксикальциферол
7-Дегидрохолестерин Витамин D3
Также витамин D3 под действием соответствующих ферментов может превращаться в различные свои формы:
X Y Z
1a-Гидроксихолекальциферол ОН Н Н
1a,25-Дигидроксихолекальциферол ОН Н ОН
1a,24,25-Тригидроксихолекальциферол ОН ОН ОН
Провитамин D3 - 7-дегидрохолестерин присутствует в кожных покровах людей, и для его превращения в холекальциферол достаточно солнечного облучения, так что суточная потребность взрослого человека (7-12 мкг) легко удовлетворяется. У детей суточная доза витамина D3 составляет 12-25 мкг. При гипо - или авитаминозе развивается рахит, поэтому необходимо поступление этого витамина со сливочным маслом, молоком, яйцами, жиром печени рыб, где его содержание наиболее велико. В лечебных целях возможно также использование витамина D2, синтезированного из эргостерина, получаемого из дрожжей, либо как побочный продукт производства антибиотиков.
Витамины D широко применяются в животноводстве, но для некоторых животных и птиц витамин D2 малоактивен и непригоден как пищевая добавка.
В организме человека витамины D вместе с ферментами, гормонами, АТФ, Na+ и другими веществами регулируют всасывание Ca2+ в кишечнике, содержание Ca2+ в крови, метаболизм Сa2+ и фосфатов, приводящий к построению нормальной костной и мышечной ткани. Большинство функций витамины D выполняют не сами, а их окисленные метаболиты: 25-гидроксикальциферол, 1a-гидроксихолекальци-ферол, 1a,25-дигидроксихолекальциферол. Эти метаболиты, открытые Г. де Лука в гг., обладают значительно более высокой биологической активностью, чем исходные витамины. Они проявляют все свойства истинных стероидных гормонов.
3.9.2 Биосинтез эргостерина
Стерины, каротиноиды, соединения групп Q-коферментов относятся к терпенам, синтезирующимся по «изопреновому правилу», по которому каротиноиды (политерпены), стерины (тритерпены), а также убихиноны и гиббереллиновая кислота синтезируются из изопреновых единиц в четыре стадии:
1) образование мевалоната из ацетил-КоА или лейцина;
2) дегидратирование и декарбоксилирование мевалонилпирофосфата с образованием «активного изопрена» - изопентенилпирофосфата и конденсация изопреновых звеньев с образованием ациклических терпенов разной длины;
3) циклизация ациклических структур;
4) дальнейшая модификация циклической структуры.
Интермедиатами синтеза стеринов являются ацетат, мевалоновая кислота, сквален, ланостерин. Сквален – общий предшественник стеринов растительного, животного происхождения и дрожжей, накапливается и при аэрации превращается в стерин. Первые две стадии синтеза стеринов схожи с синтезом каротиноидов, расхождение - на уровне фарнезилпирофосфата, который в случае стеринов димеризуется с образованием сквалена.
() Фарнезилпирофосфат ® Сквален (¯)
Затем при циклизации и отщеплении протона образуется ланостерин, предшественник холестерина и эргостерина:
Сквален Ланостерин
Превращение ланостерина в эргостерин происходит в результате следующих стадий:
1) деметилирования ланостерина;
2) трансалкилирования с образованием 24(28)-метиленовой группы и одновременным восстановлением С-24(25)двойной связи;
3) десатурации боковой цепи с образованием С-22(23) двойной связи (предполагается участие монооксигеназной системы, содержащей цитохром Р-450);
4) изомеризации D8 D7;
5) дегидрогенирования с образованием D5;
6) восстановления 24(28)-метиленовой группы до метильной.
Последовательность реакций точно не установлена, но выделен ряд веществ, которые рассматривают как интермедиаты на пути от ланостерина к эргостерину. Предполагают, что ферменты, участвующие в поздних стадиях синтеза эргостерина, локализуются в микросомах дрожжей.
3.9.3 Продуценты эргостерина
Источниками эргостерина в природе являются фитопланктон, бурые и зеленые водоросли, особенно богаты эргостерином дрожжи и плесневые грибы, которые служат сырьем для его промышленного получения. Эргостерин – основной стерин дрожжей, на который приходится 60–90 % от других стеринов: содержание эргостерина составляет 0,2-0,5 % сухой биомассы дрожжей, иногда достигает 10 %. Культурные расы дрожжей всегда богаче стеринами, чем дикие; наибольшее количество стеринов содержат пивные и пекарские дрожжи. По эргостеролсинтезирующей способности при поверхностном культивировании дрожжи располагаются в следующий ряд (исходя из процентов эргостерола в абсолютно сухих дрожжах): Saccharomyces carlsbergensis (0,49-4,30); Saccharomyces ellipsoideus (1,2-1,5); Rhodotorula glutinis (0,7-0,9); Candida utilis (0,4-0,6); Candida tropicalis (0,2-0,3). В мицелии грибов Aspergillus и Penicillium содержание стеринов 1,2-1,4 % в расчете на сухой мицелий. Penicillium westlingtii содержат 2,20 %.
Бактерии синтезируют ничтожные количества стеринов. Содержание в их клетках стеринов и сквалена составляет 0,001-0,1 мг/г сухой биомассы. Стерины обнаружены у Lactobacillus arabinosus, Lactobacillus pentosus, Escherichia coli, Azotobacter chroococcum, Micromonospora sp., Streptomyces griseus, Sphaerotillis natans, Rhodospirillum rubrum.
Большие количества сквалена синтезируют Halobacterium cutirubrum (1,0 мг/г сухих клеток) и Methylococcus capsulatus (5,5 мг/г сухих клеток). Сквален и его четыре гидроформы выделены из метанообра-зующей бактерии Methanobacillus kuzneceovii. В клетках Mycobacterium rubrum обнаружено холестерина 7,0-8,0 % от общего количества липидов.
3.9.4 Условия образования эргостерина дрожжами
Наиболее высокие количества стеринов синтезируют штаммы Saccharomyces carlsbergensis ИНМИ-101 и Saccharomyces carlsbergensis. Биомасса Saccharomyces carlsbergensis может содержать более 10 % эргостерина при условии хорошей аэрации в процессе культивирова-ния. В анаэробных условиях в клетках дрожжей накапливается предшественник эргостерина – сквален. Показано, что кислород индуцирует синтез стеринов, активируя эпоксидазу сквалена – превого фермента биосинтетического пути. Индукция синтеза эргостерина начинается при 0,03%-ном содержании О2 в газовой фазе и достигает максимума при 2%-ной концентрации.
Для биосинтеза стеринов дрожжами важно, чтобы среда содержала большой избыток углеводов и мало азота. Пекарские дрожжи, богатые белком, содержат мало стеринов. В дрожжах рода Candida высокое соотношение C:N в среде приводит к накоплению липидов, а не эргостерина.
Для дрожжей, усваивающих н-алканы, они являются лучшим источником углерода для синтеза эргостерина, чем углеводы. Это может быть связано с образованием из н-алканов ацетата (предшественника эргостерина) в результате b-окисления парафинов. Для пекарских дрожжей ацетат является хорошим источником углерода в биосинтезе стеринов.
Стимулирующее действие на образование стеринов дрожжами оказывают ингибиторы гликолиза и разобщители окислительного фосфорилирования и дыхания. Важно также присутствие в среде достаточного количества витаминов, главным образом пантотеновой кислоты, которая в составе КоА участвует в построении молекулы эргостерина.
При действии на дрожжи рентгеновского излучения содержание эргостерина увеличивается в 2-3 раза, что объясняется угнетением процесса аминирования, сопровождающегося повышением синтеза липидов. Подобно ионизирующим облучениям действуют радиомиметические вещества, нарушающие метаболизм клетки и стимулирующие липидный обмен. Например, при комбинированном воздействии на клетки дрожжей эмбихина и рентгеновского излучения выход стеринов Saccharomyces cerevisiae увеличивается на 109 % по сравнению с контролем.
Полиеновые антибиотики нистатин и филипин, взаимодействующие с мембранами дрожжей, повышают уровень стеринов в клетках на 50-60 % по сравнению с контролем.
Синтез стеринов не связан с ростом дрожжей. Содержание стеринов повышается по мере старения культуры и стеринообразование продолжается после остановки роста клеток.
Роль стеринов в метаболизме продуцентов не до конца ясна. Наблюдается связь между дыхательной активностью дрожжей и образованием эргостерина. В анаэробных условиях дрожжи содержат много сквалена и мало эргостерина. Роль эргостерина как структурного компонента мембран связывают с проницаемостью клеточных мембран.
Наиболее богата стеринами у дрожжей фракция митохондрий. Предполагается, что митохондрии принимают участие в биосинтезе стеринов, которые затем участвуют в образовании митохондриальных структур и оказывают влияние на их функциональную активность.
Стерины содержат в молекуле ОН-группу и в клетке находятся в виде эфиров жирной кислоты. Поэтому существует предположение, что образование стеринов – это реакция детоксикации, защищающая организм от избыточного синтеза жирных кислот. Стерины используются для транспорта непредельных кислот и других соединений в клетке. Микоплазмы включают стерины в клеточные мембраны. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae в условиях пониженного содержания растворенного О2 в среде поглощают экзогенные стерины, часть из которых подвергают трансформации с образованием ценных стероидов. Например, демостерин клетки дрожжей превращают в
24b-метилхолестерин, а 24,25-дигидроланостерин преобразуют в
7-дегидрохолестерин, который служит интермедиатом в биосинтезе витамина D3.
3.9.5 Промышленное получение и применение эргостерина
В промышленности эргостерин получают из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis и мицелиальных грибов. Засев производят большим количеством инокулята. Культивирование ведут при высокой температуре и сильной аэрации в среде, содержащей большой избыток источников углерода по отношению к источникам азота.
Дрожжи и грибы Aspergillus и Penicillium используют для получения кристаллического витамина D2 или концентрата. В качестве концентрата в животноводстве применяют облученные сухие дрожжи.
Максимум поглощения эргостерина наблюдается при 280 нм. Это излучение возбуждает отдельные связи колец А и В в молекуле эргостерина и вызывает его превращение в витамин D2. Облучение производят ультрафиолетовыми лампами с длиной волны 280-300 нм (сухие дрожжи) или в тонком слое 5 %-ной суспензии дрожжей. При более коротковолновом или длинноволновом излучении повышается выход других соединений стериновой природы.
На выход витамина D2 и образование других соединений влияют длительность облучения, температура, наличие примесей.
Промышленность выпускает препарат «Кормовые гидролизные дрожжи, обогащенные витамином D2». В 1 г абсолютно сухих дрожжей содержится 5000 ИЕ витамина D2, не менее 46 % сырого протеина и незаменимые аминокислоты, в том числе лизин, метионин, триптофан.
Для получения кристаллического витамина D2 дрожжи или мицелий грибов подвергают гидролизу соляной кислотой при 110 °С. Гидролизованную массу обрабатывают спиртом при 75-78 °С и после охлаждения до 10-15 °С фильтруют. Фильтрат упаривают до содержания в нем 50 % сухих веществ и используют как концентрат витаминов группы В.
Витамин D2 получают из массы, оставшейся после фильтрации. Массу промывают, сушат, измельчают и дважды обрабатывают при температуре 78 °С трехкратным объемом спирта.
Спиртовые экстракты сгущают до 70%-ного содержания сухих веществ. Таким образом получают липидный концентрат. Его омыляют раствором NaOH, а стерины остаются в неомыленной фракции. Кристаллы эргостерина выпадают из раствора при 0 °С. Очистку кристаллов проводят путем перекристаллизации, последовательным промыванием 69%-ным спиртом, смесью спирта и бензола (80:20) и повторной перекристаллизацией. Полученные кристаллы эргостерина сушат, растворяют в эфире, облучают, после чего эфир отгоняют, а раствор витамина концентрируют и кристаллизуют.
Для получения масляного концентрата раствор витамина после фильтрации разбавляют маслом до стандартного уровня.
Источником получения эргостерина может быть мицелий грибов, остающийся как отход антибиотической промышленности и производства лимонной кислоты.
Промышленное получение эргостерина возможно также из липидной фракции Candida quilliermondii, использующей н-алканы.
Сухую массу дрожжей для извлечения остаточных углеводородов экстрагируют петролейным эфиром. Получаемая при этом липидная фракция (микробный жир) является побочным продуктом. Из нее выделяют эргостерин, убихинон-9 и другие жирорастворимые соединения.
Обогащенные эргостерином, облученные ультрафиолетовым излучением дрожжи используют в животноводстве как кормовую добавку.
Эргостерин – исходный продукт для получения некоторых стероидных гормонов, лечебных и пищевых препаратов.
3.9.6 Сырье и реактивы для промышленного получения
эргостерина
При промышленном получении эргостерина по технологической инструкции требуется:
- пекарских дрожжей 600 кг;
- едкого калия 100 кг;
- спирта этилового 975 мл.
В реактор вместимостью 2 м3 загружают 600 кг дрожжей, 100 кг чешуйчатого едкого калия, 975 л этилового спирта, при перемешивании нагревают до кипения и выдерживают до шести часов при температуре 78-84 °С. Массу сливают на нутч-фильтр, при этом получают твердые остатки дрожжевых клеток и частично гидролизованных белков (белковые отходы), которые преимущественно оседают на стенках и мешалке реактора. После слива экстракта их промывают водой.
Экстракт после фильтрования упаривают до содержания сухих веществ 36-39 %, из концентрата после кристаллизации, осуществляемой при температуре 15-20 °С в течение 6-8 ч, осаждают эргостерин-сырец, содержащий около 30 % эргостерина, а также другие дрожжевые стерины и щелочь, получают 4-5 кг сырца. Его, не высушивая, подвергают двух-, трехкратному кипячению с 65%-ным этиловым спиртом в соотношении 15, 20 и 16 л на 1 л сырца, растворяя при этом щелочь и стерины (операция аффинации). После сушки при 50-60 °С получают 1,2-1,4 кг аффинированного эргостерина, содержащего не менее 88 % основного вещества и до 3 % влаги. Тпл = 157-159 °С.
ЛИТЕРАТУРА
1. Промышленная микробиология / под. ред. . - М.: Высшая школа, 1989. – 503 с.
2. Березовский, витаминов / . - М.: Наука, 1973. – 489 с.
3. Теппер, по микробиологии / , , . - М.: Колос, 1993. – 321 с.
4. Нетрусов, по микробиологии / [и др.]. – М.: Академия, 2005. – 608 с.
5. Драк, эргостерина без коагуляции дрожжевой массы / , , // Химико-фармацевтический журнал. – 1989. - № 6. – С. 41-43.
6. Бабьева, дрожжей / , . – М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. – 221 с.
Содержание
|
ВВЕДЕНИЕ______________________________________________ |
3 |
|
1 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ_________________________________ |
4 |
|
1.1 Задание_____________________________________________ |
4 |
|
1.2 Оценка жизнеспособных клеток дрожжей в сравнении |
4 |
|
1.3 Количественное определение сахаров в питательной среде после автоклавирования и культивирования___________________ |
6 |
|
1.4 Культивирование дрожжей в аэробных условиях__________ |
8 |
|
1.5 Культивирование дрожжей в анаэробных условиях________ |
10 |
|
1.6 Получение эргостерина из биомассы дрожжей_____________ |
12 |
|
2 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ________________________________ |
15 |
|
2.1 Общая характеристика дрожжей________________________ |
15 |
|
2.2 Систематика дрожжей_________________________________ |
16 |
|
2.3 Классификация дрожжей_______________________________ |
18 |
|
2.4 Распространение дрожжевых грибов в природе____________ |
24 |
|
2.5 Особенности метаболизма дрожжей_____________________ |
26 |
|
2.6 Продукты метаболизма________________________________ |
33 |
|
2.7 Лимитирующие факторы_______________________________ |
34 |
|
3 ПРОМЫШЛЕННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДРОЖЖЕЙ_________ |
40 |
|
3.1 История использования________________________________ |
40 |
|
3.2 Традиционные процессы_______________________________ |
40 |
|
3.3 Виноделие___________________________________________ |
42 |
|
3.4 Пивоварение_________________________________________ |
43 |
|
3.5 Хлебопечение________________________________________ |
45 |
|
3.6 Дрожжи как источник белка____________________________ |
48 |
|
3.7 Производство этанола_________________________________ |
50 |
|
3.8 Различные продукты, получаемые из дрожжей____________ |
54 |
|
3.9 Эргостерин__________________________________________ |
56 |
|
ЛИТЕРАТУРА____________________________________________ |
65 |
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Учебное пособие
Редактор
Подписано в печать 21.08.2007. Формат 60´84 1/16
Усл. п. л. - 4,1. Уч.-изд. л. - 4,4
Печать - ризография, множительно-копировальный
аппарат «RISO TR-1510»
Тираж 100 экз. Заказ 2007-49
Издательство Алтайского государственного
технического университета
г. Барна
Оригинал-макет подготовлен ИИО БТИ АлтГТУ
Отпечатано в ИИО БТИ АлтГТУ
9
|
|
