Влияние подострой и хронической интоксикации этанолом на функцию популяций лимфоцитов и цитокиновый профиль

ВЛИЯНИЕ подострой и хронической интоксикации ЭтАНОЛОМ на функциЮ популяций лимфоцитов И цитокиновЫЙ профиль

,

В экспериментах на неинбредных белых крысах установлено, что подострая интоксикация этанолом (7 сут, суммарная доза – 1,4 DL50) существенно снижает концентрацию в крови цитокинов ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, увеличивает содержание в крови ИЛ-6, супрессирует иммунные реакции, снижает функции Th1- Th2-клеток в равной степени. Хроническая интоксикация этанолом (30 сут, суммарная доза – 6,0 DL50) вызывает более выраженную редукцию иммунных реакций и цитокинов ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и вызывает поражение Th1-клеток в большей степени по сравнению с Th2-лимфоцитами. При этом концентрация в крови ИЛ-6 существенно возрастает.

Ключевые слова: этанол, иммунотоксичность, цитокины, Тh1, Th2-лимфоциты.

Этиловый спирт (Э, этанол) используется как антиобледенитель в авиации, растворитель для морилок, политур, клея и т. п., в медицинской практике применяется как антисептик и консервант, употребляется при приготовлении настоек и экстрактов в фармацевтической промышленности и в быту [1]. К числу ведущих факторов, обусловливающих демографический кризис в России относится рост потребления алкоголя. Алкогольные отравления в течение многих лет занимают ведущее место среди бытовых отравлений по абсолютному числу смертельных исходов (в России более 60% всех смертельных отравлений обусловлены этанолом) [1,3]. В последние годы число больных с диагнозом острого отравления алкоголем составляет в среднем 20% и более от общего числа госпитализаций [1,2]. За последние 5 лет данная ситуация практически не изменилась, более того, поступление в медицинские учреждения лиц с интоксикацией этанолом имеет тенденцию к увеличению. Следует учитывать, что острое отравление алкоголем происходит, как правило, на фоне его употребления в течение нескольких суток или при сформировавшемся хроническом алкоголизме.

Смертность после острых, подострых и хронических интоксикаций Э может быть связана с инфекционными осложнениями и заболеваниями, обусловленными снижением показателей иммунного статуса [1]. Знание иммунопатогенеза действия Э при подостром и хроническом отравлениях необходимо для обоснования фармакологической коррекции постинтоксикационного нарушения иммунного статуса с целью профилактики различных инфекционных осложнений и заболеваний [1].

От особенностей поражения антигенпредставляющих клеток, популяций Т-лимфоцитов, В-клеток Э зависит характер формирования вторичного иммунодефицитного состояния, и, следовательно, способы коррекции нарушений иммунного статуса [1,4]. Известно, что Т-лимфоциты хелперы неоднородны и состоят из лимфоцитов Th0-, Th1-, Th2-, Th3-типа [6]. Лимфоциты Th0- типа синтезируют ИЛ-2, который стимулируют пролиферацию В-клеток. Кроме того, они выделяют многочисленные цитокины, продуцируемые Th1-, Th2-клетками (и другими клетками), за исключением ИЛ-12, который выделяют только Th2-лимфоциты [4]. Th1-клетки продуцируют γ-интерферон (ИФН-γ), участвуя в реализации клеточных иммунных реакций [4,6,10], кроме того, они обеспечивают синтез В-лимфоцитами (плазмоцитами) IgM и IgG2а [10]. Th2-лимфоциты, синтезируя ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-13, способствуют активации, пролиферации и дифференцировке В-клеток, синтезу плазмоцитами основных классов и подклассов иммуноглобулинов (IgG1-4, IgА1, IgА2 IgЕ и IgD). Кроме того, ИЛ-4 и ИЛ-13 ингибируют продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами, а ИЛ-10, продуцируемый Th0-и Th2- клетками и макрофагами, снижает синтез цитокинов Th1-лимфоцитами [4,6,10].

В формировании аллергических и анафилактических реакций также участвуют лимфоциты Th1-и Th2-типа. Контактые (кожные) аллергические реакции связаны с функцией Th1-лимфоцитов, а респираторные аллергические реакции – с активностью Th2-лимфоцитов (синтез IgE) [1,4,10]. От соотношения активности лимфоцитов Th1-, Th2-типа (парадигма двух видов хелперов - Th1/Th2 [13]) может зависеть вероятность возникновения соответственно вирусных или микробных инфекций [7], также формирование контактной или респираторной гиперчувствительности [9,11].

Целью исследования являлась оценка иммунных реакций, отражающих функцию Тh1- и Th2-лимфоцитов, и цитокинового профиля (содержание в крови ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10) при подострой и хронической интоксикации этанолом.

Опыты проводили на неинбредных белых крысах обоего пола массой 180-240 г. Этанол вводили ежедневно, однократно per os в 40% водном растворе в дозе 0,2 DL50 в течение 7 и 30 сут (подострая и хроническая интоксикация соответственно) DL50 этанола составляла 12,3+1,3 г/кг. Контрольная группа животных получала перорально соответствующий объем воды. Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунотоксикологии и иммунологии [1,4]. Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому антигену (эритроцитам барана - ЭБ), характеризующую способность Th1-лимфоцитов участвовать в продукции плазматическими клетками IgM, определяли по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке через 4 сут после иммунизации (пик продукции IgM), которую проводили внутрибрюшинно в дозе 2·108 на 3 и 26 сут после первого введения Э соответственно при подострой и хронической интоксикации. Функцию Th1-лимфоцитов оценивали по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Формирование ГЗТ, исследовали у животных по приросту массы стопы задней лапы в %. Разрешающую дозу ЭБ (5·108) вводили под апоневроз стопы задней лапы через 4 сут после внутрибрюшинной иммунизации на 3 и 26 сут после первого введения Э соответственно при подострой и хронической интоксикации. Реакцию ГЗТ оценивали через 24 ч. Функцию Th2-лимфоцитов исследовали по числу АОК, синтезирующие IgG к ЭБ, в селезенке через 7 сут после иммунизации методом непрямого локального гемолиза в геле [4]. При этом крыс иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2·108 клеток одновременно с первым введением Э и на 23 сут соответственно при подострой и хронической интоксикации. Таким образом, при оценке всех иммунных реакций животные получали суммарную эквилетальную дозу Э, составляющую при подострой и хронической интоксикации соответственно 1,4 и 6,0 DL50.

Концентрацию цитокинов ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10 исследовали в плазме крови крыс через 7 и 30 сут после первой инъекции Э методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента.

При воздействии Э в течение 7 и 30 сут (табл. 1) отмечалось уменьшение гуморального иммунного ответа к Т-зависимому антигену (по числу АОК в селезенке), характеризующему синтез IgM В-клетками и функцию Th1-лимфоцитов, по сравнению с контрольным уровнем соответственно в 1,41 и 3,31 раза (p<0,05). При подострой и хронической интоксикации Э отмечалась существенная супрессия реакции ГЗТ (функция Th1-клеток) соответственно в 1,49 и 2,98 раза (p<0,05), а функция Th2-лимфоцитов (оцениваемая по числу АОК, синтезирующих IgG к ЭБ) – в 1,40 и 2,21 раза соответственно (p<0,05).

При подострой и хронической интоксикации Э характеризующие иммунные реакции и связанную с ними функцию Th1-лимфоцитов параметры в среднем снижались соответственно в 1,45 и 3,15 раза, а показатели, связанные с функцией Th2-клеток, – в 1,40 и 2,21 раза соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что функция Th1- и Th2-лимфоцитов под влиянием подострой интоксикации Э снижается в равной степени. Хроническая интоксикация Э вызывает супрессию активности Th1-лимфоцитов в большей степени по сравнению с редукцией функции Th2-клеток.

Таблица 1

Влияние подострой и хронической интоксикации этанолом на функцию Th1- и Th2- лимфоцитов у крыс (М+m, n = 9-12)

Примечание: 1, 2- подострая и хроническая интоксикация соответственно; * - p<0,05 по сравнению с контролем.

Более выраженное снижение активности Th1-клеток при хронической интоксикации Э по сравнению с подострым отравлением может быть обусловлено длительным увеличением в крови концентрации кортикостерона [1], к которому при действии Э в течение 30 сут в большей степени чувствительны лимфоциты Th1-типа по сравнению с Th2-лимфоцитами [4]. Поражение Т-лимфоцитов и других клеток этанолом, видимо, происходит в результате нарушения их функции вследствие взаимодействия с сульфгидрильными и аминогруппами ферментов высокотоксичного продукта биотрансформации этанола ацетальдегида, мембранотоксического действия этилового спирта и его метаболита, инициацией перекисного окисления липидов, ингибированием тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования [1].

Установлено уменьшение содержания ИФН-γ и ИЛ-4 в плазме крови крыс через 7 сут при действии Э соответственно в 1,38 и 1,40 раза (p<0,05), а через 30 сут - в 3,82 и 2,85 раза соответственно (p<0,05) (табл. 2). Соотношения ИФН-γ/ИЛ-4 при подострой интоксикации Э практически не изменялось по сравнению с контрольным значением. Это характеризует поражение Th1- и Th1-лимфоцитов в равной степени. Снижение соотношения ИФН-γ/ИЛ-4 при хронической интоксикации Э (5,6) по сравнению с контролем (7,5) свидетельствует о большей супрессии активности Th1- лимфоцитов по сравнению с функцией Th2-клеток (p<0,05) [5].

Содержание в плазме крови ИЛ-2 и ИЛ-10 при подострой интоксикации Э снижались соответственно в 1,37 и 1,45 раза (p<0,05), а при хронической – в 3,10 и 2,05 соответственно (p<0,05). Концентрация ИЛ-6 при подостром и хроническом воздействии этанола увеличивалась в 1,34 и 1,53 раза (p<0,05) соответственно.

Таблица 2

Влияние подострой и хронической интоксикации этанолом на содержание цитокинов в плазме крови крыс, пг/мл (М+m, n = 7)

Примечание: 1, 2- подострая и хроническая интоксикация соответственно;

* - p<0,05 по сравнению с контролем.

Редукция в плазме крови под влиянием этанола ИЛ-2 свидетельствует о супрессии его продукции Т-лимфоцитами (Th0- типа, цитотоксическими Т-клетками), редукции пролиферации Т - и В-клеток, активности естественных клеток-киллеров [4,6].

Увеличение в крови ИЛ-6 (провоспалительного цитокина), вероятно, характеризует увеличение его продукции макрофагами, моноцитами и лимфоидными дендритными клетками в печени вследствие ее поражения алкоголем (реализация воспалительного процесса) [1,4,6,10].

Уменьшение в плазме крови концентрации ИЛ-10 (антивоспалительного цитокина) свидетельствует о редукции этанолом функции Th0-, Th2-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и В-клеток. Этот цитокин способен уменьшать секрецию ИФН-γ Th1-лимфоцитами [10,12]. Этот эффект характерен для тяжелых металлов [8], динитрохлорбензола, формальдегида и других токсикантов [14]. Снижение синтеза ИЛ-10 при хронической интоксикации Э в меньшей степени, чем ИФН-γ, подтверждает установленный нами больший поражающий эффект этанола при его действии в течение 30 сут в отношении Th1-лимфоцитов. Относительно небольшая редукция ИЛ-10 при хронической интоксикации Э, вероятно, обусловлена значительным снижением синтеза ИФН-γ этанолом, что, вероятно, исключает регулирующее повышение Th0-, Th2-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами и В-клетками продукции ИЛ-10, который способен усилить супрессию функции Th1-лимфоцитов в еще большей степени.

ВЫВОДЫ

1. Подострая интоксикация этанолом (0,2 DL50, однократно, ежедневно в течение 7 сут) вызывает поражение функции Th1- и Th2-лимфоцитов в равной степени. Хроническая интоксикация этанолом (0,2 DL50, однократно, ежедневно в течение 30 сут) вызывает супрессию активности Th1-лимфоцитов в большей степени по сравнению с редукцией функции Th2-клеток.

2. Под влиянием подострой интоксикации этанолом существенно снижается концентрация в крови цитокинов ИФН - γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, а содержание ИЛ-6 увеличивается. При хронической интоксикации этиловым спиртом снижение ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 и увеличение ИЛ-6 более выражено, при этом редукция в крови содержания ИФН-γ, отмечается в большей степени, чем ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10.

ЛИТЕРАТУРА

1. , Мандыч ксенобиотиков: Монография. – Саратов: СВИБХБ, 2007. – 420 с.

2. , // Токсиколог. вестник – 2004. –№4. –С. 2–11.

3. , Костомарова отравления: Руководство для врачей. 2-е изд., перераб и доп. – М.:Медицина, 2000. – 434 с.

4. Бростофф Дж., Иммунология. Пер. с англ. –М.: Мир, 2000. – 582 с.

5. , , и др. // Бюл. эксперим. биол. и мед.-2005. –Т. 140, № 12. –С. 622 –624.

6. , , Сидорович . – 2-е изд., перераб. и доп. –М.: Медицина, 2002. – 536 с.

7. Asquith B., Zhang Y., Mosley A. J., de Lara C. M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2007. – Vol. 104. – № 19. – P. 8035–8040.

8. Chen J. Y., Yu W., Liu W. W., Luo Y. // Zhonghua Lao Doyg Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. – 2007. –Vol. 52. –№ 3.- P. 1319–1326.

– P. 279–281.

9. Corsini E., Kimber I. // Toxicol. Lett. –2007. – Vol.168. –№3. –P.255–299.

10. Georgiev V. St., Albright J. E. // Immunomodulation drugs / Ann. of the N.-Y. Acad. Sci. – 1993. – Vol. 685. – P.284 –602.

11. Hsu H. Y., Lin B. F., Lin J. Y. et al. // J. Agric. Food. Chem. –2003. – Vol. 51. –№ 13. – P..

12. Kim H. S. Eom J. H., Cho H. Y. et al. // J. Toxicol. Environ. Health.- 2007. – Vol. 70. –№15-16. – P. .

13. Romagnani S. // Immunol. Today. –1997. – Vol. 18. – №6. –P. 263 –266.

14. Urlich P., Grenet O., Bluemel J. et al. // Arch. Toxicol. – 2001. – Vol. 75. – № 8.- P. 470-479.