На правах рукописи

СНИГИРЕВА ГАЛИНА ПЕТРОВНА

Последствия воздействий ионизирующих излучений: цитогенетические изменения в лимфоцитах крови человека

03.00.01-03 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва-2009

Работа выполнена в Российском научном центре рентгенорадиологии «Росмедтехнологий»

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Ведущая организация - Российский научный центр радиологии и хирургических технологий «Росмедтехнологий», г. Санкт-Петербург

Защита состоится «____»__________2009 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д.501.00.65 при Московском Государственном Университете им. Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. 557.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. . Отзывы просим присылать Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет. Факс (4

Автореферат разослан «___»_________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Человеку приходится сталкиваться с источниками ионизирующего излучения при самых разных обстоятельствах. Наряду с медицинским облучением населения в диагностических и терапевтических целях, использование радиоактивных источников в различных областях науки, промышленности и медицины не исключает возможности профессионального облучения специалистов. В условиях постоянного повышенного радиационного фона работают космонавты, которые совершают длительные полеты на околоземной орбите.

Применение ядерных технологий с использованием источников ионизирующего излучения в военных и мирных целях могут создавать опасность радиационных аварий, когда в результате радиоактивного загрязнения местности облучению могут подвергаться многочисленные группы людей, а внештатные ситуации на предприятиях атомного комплекса могут приводить к переоблучению персонала. Примерами таких ситуаций являются аварии на ядерном реакторе в Селлафильде в Англии в 1957г., на производственном объединении «Маяк» на Урале в 1957г., на атомной станции Три Майл Айленд в США в 1979г. и Чернобыльской атомной станции в 1986г.

Для того чтобы предсказать тяжесть радиационного поражения организма, вовремя оказать эффективную помощь, а также оценить возможные последствия облучения, необходимо иметь достоверную информацию о полученной дозе ионизирующего излучения. При радиационных авариях, в случаях неконтролируемого облучения данные физической дозиметрии часто бывают ограничены, нуждаются в уточнении или могут полностью отсутствовать. Подобные ситуации имели место при облучении населения в результате ядерных взрывов на Семипалатинском полигоне, сброса радиоактивных отходов в р. Теча в Челябинской области, аварии на Чернобыльской АЭС. В таких случаях особое значение приобретают биологические маркеры радиационного воздействия. На сегодняшний день общепризнанно, что наиболее информативными и чувствительными являются цитогенетические показатели, а именно хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови (Дубинина, 1977; Севанькаев, Насонов, 1979; Пяткин, Нугис, 1981; Bender et al, 1988; Tawn, Whitehouse, 2003; Terzoudi, Pantelias, 2006; Simon et al., 2007, Obe, 2007).

Принципы цитогенетического метода дозиметрии и индикации радиационного воздействия достаточно убедительно обоснованы во многих отечественных и зарубежных исследованиях, результаты которых послужили основой для выработки рекомендаций ВОЗ, МАГАТЭ и НКДАР ООН по практическому использованию анализа хромосомных аберраций в лимфоцитах крови в качестве тест-системы для количественной оценки мутагенных факторов радиационной природы (WHO, 1976; IAEA, 1986, 2001; UNSCEAR, 1986). Информация о «биологической» дозе, полученная с помощью цитогенетических методов, шире, чем ее физическое значение, т. к. она отражает не только результат радиационного воздействия, но и его индивидуальную радиочувствительность, что позволяет более корректно прогнозировать ранние и отдаленные последствия облучения.

Анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови нашел широкое применение при молекулярно-эпидемиологическом обследовании людей, подвергшихся облучению (Brogger et al., Hagmar et al., 1990, 1994; Brooks, 1999;

Bonassi et al., 2000, 2001, 2002; Durante et al., 2001;). Известно, что повреждение генетического аппарата клетки, которое может проявляться на уровне структурных перестроек хромосом в виде симметричных транслокаций, в ряде случаев лежит в основе радиационного канцерогенеза (Rowley, 1998; Bonassi, 1999; Mitelman et al., 1997, 2006; Rossner et al., 2005). Однако к нерешенным вопросам относится роль соматических мутаций в развитии неопухолевой патологии. Повышенный уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови может предшествовать развитию патологических процессов или просто быть индикатором неблагополучия в организме человека. Имеющиеся данные о взаимосвязи хромосомных аберраций с соматическими заболеваниями у лиц, подвергшихся облучению в процессе профессиональной деятельности или в результате проживания на радиационно-загрязненных территориях, не являются однозначными и свидетельствуют о необходимости проведения систематических исследований в этом направлении для получения более детальной информации.

В большинстве случаев, при которых люди подвергаются воздействию радиации, как от естественных, так и от техногенных источников, речь идет об облучении в небольших дозах. Поэтому главную озабоченность вызывают последствия радиационного воздействия в малых дозах, особенность биологического действия которых до сих пор является предметом активных дискуссий (Воробцова, 1974, 1991, 2006; Кузин, 1977, 1991, 1995; Шевченко, Померанцева, 1985; Спитковский, 1992; Бурлакова, 1994; Пелевина и др., 1996, 2003; Upton, 2001; Bonner, 2003; Morgan, 2003; Preston, 2003; Булдаков и Калистратова 2003, 2005; Enns et al., 2004; Mothersill, Seymour, 2004 и др.; Москалев и Зайнуллин, 2004). При этом количественная оценка малых доз, а также возможных последствий облучения остаются проблемами, сталкивающимися с серьезными научными и методическими трудностями. В связи с этим одной из актуальных задач радиационной биологии является разработка чувствительных критериев, с помощью которых можно объективно судить об опасности воздействия радиации, особенно в малых дозах, на организм человека. Естественно, что эта задача может быть успешно решена только на основе данных цитогенетического мониторинга людей, подвергшихся облучению при различных аварийных и чрезвычайных ситуациях.

Цель и задачи исследования

Основной целью работы было изучение цитогенетических эффектов облучения в лимфоцитах периферической крови человека и возможность их применения для количественной оценки воздействия ионизирующего излучения и прогноза неблагоприятных медицинских последствий.

Поставленная цель определила решение следующих задач:

1) исследовать спектр и частоту хромосомных аберраций стабильного и нестабильного типов в лимфоцитах периферической крови лиц, подвергшихся облучению при различных ситуациях:

·  у профессионалов, подвергшихся радиационному воздействию в процессе производственной деятельности и при внештатных ситуациях;

·  у жителей загрязненных радионуклидами территорий;

·  у участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС;

2) изучить дозовую зависимость частоты хромосомных аберраций при воздействии гамма - и бета-излучения in vitro при разных мощностях дозы и построить калибровочные кривые «доза-эффект»;

3) изучить цитогенетические эффекты разных видов ионизирующего излучения (гамма-, бета - и космическое излучение) и определить их относительную биологическую эффективность;

4) оценить индивидуальные и среднегрупповые дозы радиационного воздействия по частоте хромосомных аберраций стабильного и нестабильного типов в обследованных группах;

5) установить взаимосвязь между заболеваемостью и уровнем цитогенетических повреждений в лимфоцитах периферической крови в группах профессионалов и участников ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС;

На защиту выносятся следующие положения:

1. Цитогенетические повреждения в лимфоцитах периферической крови лиц, подвергшихся облучению в результате аварийных и чрезвычайных ситуаций, являются объективным показателем радиационного воздействия и могут быть использованы для биологической оценки дозы.

2. Хромосомные аберрации нестабильного типа являются чувствительным биологическим маркером, который может быть использован для прогноза неблагоприятных медицинских последствий облучения и формирования групп риска в отношении развития соматической патологии.

Научная новизна работы. Впервые проведено масштабное цитогенетическое обследование людей, которые подвергались облучению преимущественно в низких дозах вследствие радиационных аварий (население, проживающее на загрязненных радионуклидами территориях) и при различных ситуациях (профессионалы, подвергшиеся радиационному воздействию в процессе производственной деятельности и участники ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС).

Впервые представлены результаты многолетнего цитогенетического мониторинга космонавтов, принимавших участие в полетах на станции «Мир» и Международной космической станции (МКС).

Впервые для профессионального облучения проведено сравнение цитогенетической эффективности разных видов ионизирующего излучения (гамма-, бета-, космическое излучение) и определены коэффициенты относительной биологической эффективности (ОБЭ).

Получены калибровочные кривые «доза-эффект» для хромосомных аберраций стабильного и нестабильного типов, позволившие оценить индивидуальные и среднегрупповые дозовые нагрузки в ранние и отдаленные периоды после радиационного воздействия.

Установлена взаимосвязь между цитогенетическими показателями крови и результатами медицинского обследования лиц, подвергшихся радиационному воздействию в процессе профессиональной деятельности и при аварийной ситуации.

Практическое значение работы. Результаты работы используются в практической деятельности Республиканского экспертного совета Российского научного центра рентгенорадиологии по установлению связи заболеваний с предшествовавшим радиационным воздействием (цитогенетическое обследование участников ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС, а также лиц, подвергшихся облучению в результате других аварийных и чрезвычайных ситуаций). По частоте стабильных хромосомных аберраций проводится оценка доз облучения, а результаты цитогенетического обследования являются одним из критериев при формировании групп риска в отношении развития соматической патологии. Полученная информация позволяет более эффективно применять профилактические и лечебные мероприятия, направленные на снижение и возможное предотвращение негативных последствий облучения.

Результаты работы использованы при подготовке методических указаний и методических рекомендаций МЗ РФ, а также пособий для врачей.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: Международном рабочем совещании «Методы в радиационной цитогенетике», 1991 (Мюнхен, Германия); Международном совещании «Определение доз у населения после аварии на Чернобыльской АЭС», 1994 (Мюнхен, Германия); III Международном рабочем совещании «Методология реконструкции доз», 1995 (Брюссель, Бельгия); Международной конференции «Радиация и здоровье», 1996 (Беэр Шева, Израиль); Рабочем совещании НАТО, 1997 (Киев); XII Международном симпозиуме «Человек в космосе», 1997 (Вашингтон, США); III и V съездах по радиационным исследованиям, 1997, 2006 (Москва); IV Международной конференции по экологическому образованию, 1998 (Пущино); XI конференции по космической биологии и авиакосмической медицине, 1998 (Москва); Международной научной конференции в рамках года России на Украине, 2003 (Одесса); Международном симпозиуме «Хроническое радиационное воздействие: возможности биологической индикации», 2000 (Челябинск); Международной конференции «Радиоактивность при ядерных взрывах и авариях», 2000 (Москва); Международной конференции «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков», 2000 (Москва); II Международном рабочем совещании «Радиационная безопасность пилотируемых полетов на Марс», 2003 (Дубна); Международных конференциях «Генетические последствия чрезвычайных и радиационных ситуаций», 2002, 2005 (Москва, Дубна); I и II Международном совещании «Человек и электромагнитные поля», 2003, 2007 (Саров); II Международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, экологии и эволюции», 2005 (Ереван); VI Международной научной конференции «Экология человека и природа», 2004 (Плес); XVII рабочем совещании NASA, 2006 (Санкт-Петербург); VII Международной конференции по применению источников радиации в промышленности, 2008 (Прага, Чехия); XXXVI Международной конференции Европейского общества по радиационным исследованиям, 2008 (Тур, Франция); Международной научно-практической конференции «Чернобыльские чтения – 2008». 2008 (Гомель); Международной конференции «Системы жизнеобеспечения как средство освоения человеком дальнего космоса», 2008 (Москва); научно-практической конференции РНЦРР, 2009 (Москва); V съезде радиобиологического общества Украины, 2009 (Ужгород).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 137 печатных работ, в том числе: 25 статей в российских и зарубежных журналах из списка ВАК, 29 статей в сборниках и журналах, 5 методических указаний и рекомендаций МЗ РФ и 54 тезиса международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания объектов и методов исследования (глава II), изложения полученных результатов и их обсуждения (главы III, IV, V), выводов и списка литературы. Текст иллюстрирован таблицами и рисунками. Список литературы включает отечественных и зарубежных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дано обоснование актуальности выбранной темы в связи с имеющимися на сегодняшний день исследованиями, посвященными оценке и прогнозу последствий радиационного воздействия в малых дозах на человека. Сформулированы цели и задачи исследования.

В I главе представлен обзор данных литературы по цитогенетическим показателям крови и их применению для оценки мутагенных факторов окружающей среды, с акцентом на воздействие радиационных факторов. Обсуждается возможность использования анализа хромосомных аберраций в лимфоцитах крови для индикации и количественной оценки радиационного воздействия. Представлен обзор цитогенетических методов, которые применяются в биологической дозиметрии.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика групп обследования. По отношению к облучению все обследованные в рамках представленной работы люди разделены на две группы. Первая группа объединяет профессионалов, т. е. лиц, которые постоянно или временно контактируют с источниками ионизирующего излучения в процессе производственной и научной деятельности. Вторая группа включает население, которое подверглось радиационному воздействию в результате различных аварийных ситуаций. В отдельную группу выделены участники ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС (ликвидаторы). Характеристика групп (включая и группы сравнения) представлена в таблице 1.

Цитогенетическое обследование включало анализ нестабильных хромосомных аберраций с применением классического цитогенетического метода и стабильных хромосомных аберраций с применением метода флуоресцентной гибридизации in situ с ДНК-пробами (FISH метод). С помощью классического цитогенетического метода обследовано 2084 человека, с применением FISH метода -191человек.

Методика проведения цитогенетического анализа. Культивирование лимфоцитов периферической крови и приготовление хромосомных препаратов проводили с использованием стандартного протокола (Moorhead et al., 1960, Bauchinger et al., 1998). Культуральная среда RPMI 1640 содержала 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2,5% фитогемагглютинина, 10 мМ 5-бромдезоксиуридина и антибиотики. Инкубацию клеточной культуры проводили при 370С в течение 48 часов.

Препараты метафазных хромосом, предназначенные для анализа нестабильных хромосомных аберраций, окрашивали с использованием технологии «флюоресценция плюс краситель Гимза» (FPG-метод), позволяющей определять долю клеток, находящихся на стадии первого митотического цикла (Apelt et al., 1981). При микроскопировании учитывали все типы хромосомных аберраций, распознаваемые без кариотипирования.

Таблица 1

Характеристика обследованных групп

*сотрудники, подвергавшиеся гамма-излучению в процессе профессиональной деятельности; **сотрудники, контактировавшие с бета-излучением трития и его окиси; ***ликвидаторы, работающие на предприятиях атомной промышленности.

Анализ стабильных хромосомных аберраций проводили с помощью метода окрашивания, основанного на молекулярной гибридизации ДНК зонда с ДНК метафазных хромосом, фиксированными на предметном стекле (in situ) и с последующим использованием флуоресцентной микроскопии для детекции результатов гибридизации (FISH метод). Для анализа использовали коктейль проб: меченые биотином ДНК-пробы для 1, 4 и 12 хромосом в комбинации с меченой дигоксигенином панцентромерной пробой. Процедуру окрашивания проводили по методу (Pinkel et al.,1986) в модификации (Bauchinger et al., 1993). Для выявления гибридных молекул ДНК применяли иммунохимическое окрашивание препаратов
хромосом с использованием FITC-меченого стрептавидина и конъюгированного с биотином антистрептавидина для хромосомных проб и АМСА – меченых антител для панцентромерных проб. Часть препаратов обрабатывали с помощью коммерческих наборов фирмы MetaSystems GmbH, которые включают ДНК зонды, специфичные к 1, 4 и 12 хромосомам человека. При проведении цитогенетического анализа учитывали «полные» (реципрокные, tc) и «неполные» (нереципрокные, ti) транслокации, инсерции и комплексные хромосомные обмены. Пересчет частоты обменных аберраций с участием окрашенных хромосом на геномную частоту этих событий проводили по формуле (Lucas et al., 1992).

Статистический анализ результатов исследования проводили с применением параметрических и непараметрических методов, который включал анализ различий и связей (Гланц, 1999; Савилов и др., 2004; Реброва, 2006). Для расчетов использовали пакет программ STATISTICA (StatSoft. USA-Russia, версия 6.1). Достоверность статистических гипотез оценивал при пороговом уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Спонтанный уровень хромосомных повреждений в лимфоцитах крови

Для корректной оценки результатов цитогенетического обследования у лиц, подвергшихся радиационному воздействию при различных ситуациях, проведен анализ уровня хромосомных повреждений в группах сравнения, в которые вошли люди, предположительно никогда ранее не подвергавшиеся воздействию ионизирующего излучения (кроме медицинских диагностических исследований).

Нестабильные хромосомные аберрации. Средняя частота хромосомных аберраций в группе жителей Московского региона в 1,5 – 2 раза достоверно ниже аналогичного показателя в других группах сравнения (табл. 2). Повышенный уровень хромосомных аберраций обусловлен, главным образом, аберрациями хроматидного типа и ацентрическими фрагментами. Одной из причин повышенного уровня ацентрических фрагментов может быть хроническое воздействие малых доз ионизирующего излучения с низкой ЛПЭ (Balakrischan, Rao, 1999; Севанькаев и др., 2005). Аберрации хроматидного типа являются в основном показателем влияния на организм мутагенных факторов химической природы. Повышенный уровень хроматидных аберраций может свидетельствовать о загрязнении окружающей среды мутагенами нерадиационной природы, в том числе различными химическими веществами и пестицидами.

Особого внимания заслуживает частота дицентриков и центрических колец – маркеров радиационного воздействия. По полученным данным, этот показатель имеет наибольшее значение в группе космонавтов, обследованных до первого полета (в 5 раз достоверно выше аналогичного показателя в группе жителей Московского региона). По-видимому, уровень дицентриков и центрических колец в крови космонавтов до полета отражает радиационную нагрузку, полученную за счет рентгенодиагностических исследований, которые неоднократно проводят космонавтам в процессе подготовки к полету. Одной из причин более высокой частоты дицентриков и центрических колец в группе жителей г. Сарова является влияние повышенного радиационного фона в городе, обусловленного деятельностью предприятия атомного комплекса.

Стабильные хромосомные аберрации. Средняя частота транслокаций (FISH метод) с участием окрашенных хромосом, в группе жителей Павлодарского района Казахстана в 2 раза выше аналогичного показателя в группе жителей Московского региона (табл. 2). Такие различия нельзя объяснить только с позиции возраста - средний возраст в контрольной группе из Москвы составляет 44 года, а у жителей Казахстана – 55 лет. Скорее всего, повышенный уровень стабильных хромосомных аберраций может быть результатом воздействия на организм мутагенных факторов радиационной и химической природы. Подтверждением данного предположения является наблюдаемый повышенный уровень аберраций хромосомного и хроматидного типов при анализе с помощью классического цитогенетического метода.

В группе космонавтов средняя частота транслокаций также почти в 2 раза выше по сравнению с группой жителей из Московы. Результаты, полученные с помощью FISH метода при обследовании космонавтов, подтверждают возможное влияние радиационного воздействия за счет рентгенодиагностических процедур.

Таким образом, цитогенетическое обследование групп сравнения, показало, что хромосомные аберрации с небольшой частотой встречаются у большинства абсолютно здоровых людей, не подвергавшихся техногенному облучению. Спонтанный уровень хромосомных аберраций зависит в первую очередь от места проживания, т. е. определяется экологическими условиями. Существенное влияние на уровень хромосомных аберраций могут оказывать рентгенодиагностические исследования, а также производственные и бытовые факторы генотоксического характера, с которыми человеку приходится сталкиваться на протяжении всей жизни. Достоверных различий по частоте нестабильных хромосомных аберраций в зависимости от пола, возраста и курения не выявлено. В целом, все обследованные группы лиц характеризуются достаточно низкими значениями частот стабильных и нестабильных хромосомных аберраций, которые близки с данными других исследователей.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5