Генетика как наука. Предмет, проблемы, задачи, методы генетики. Основные этапы развития генетики (стр. 7 )

У самого Tn3 центральная часть содержит гены транспозазы, резолвазы и бета-лактамазы bla (обеспечивает устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда). Ген транспозазы tnA кодирует большой белок из примерно 1000 а. о., ген резолвазы tnR кодирует белок из 185 а. о. Гены транспозазы и резолвазы транскрибируются в противоположных направлениях с промоторов, расположенных в межгенном пространстве длиной 170 п. н. В межгенном пространстве находится и сайт res, по которому происходит разрешение коинтегратов. Транскрипции генов резолвазы и транспозазы конкурируют друг с другом, и ген резолвазы выступает как ген-регулятор гена транспозазы.

К семейству Tn3 относятся Tn1, Tn1000 и др.

Нерепликативная транспозиция заключается в вырезании элемента и его перемещении в новое место. При этом 2 молек-OH-концы элемента соединяются с 5-Р-концами ДНК-мишени, а между 3’-OH-концами ДНК-мишени и 5’-Р - концами элемента образуется брешь, которая заполняется с помощью репаративного синтеза ДНК, в результате чего на концах мобильного элемента возникают ДПП строго фиксированной длины.

В исходном репликоне остается ДНР. Будет ли он репарирован – зависит хозяйской клетки.

Этот механизм характерен для большинства мобильных элементов бактерий и эукариотических элементов с короткими ИП. По такому типу перемещаются многие IS-элементы и мобильные элементы, которые называют составными: Tn5, Tn9, Tn10 и другие. Составные транспозоны отличаются тем, что у них инвертированные повторы представлены IS-элементами, которые находятся в обратной или (гораздо реже, например, Tn9) в прямой ориентации.

Вопрос №69

У эукариот широко распространены ретротранспозоны, в транспозициях которых задействованы фермент обратная транскриптаза (ревертаза) и РНК-копия элемента в качестве интермедиата. Ретроэлементы подразделяются на 2  группы:

1) Ретротранспозоны с длинными прямыми концевыми повторами (ДКП) (класс I.1 ). Их структура соответствует ДНК-копиям геномов ретровирусов позвоночных, которые также являются мобильными элементами.

2) Ретроэлементы (класс I.2 ), не содержащие повторов на концах (некоторые авторы используют для них название «ретропозоны»).

Ретровирусы являются «прототипами» ретротранспозонов.

У ретроэлементов с ДКП транспозиция происходит по схеме, включающей РНК-интермедиат.

С геномной ДНК элемента транскрибируется РНК-копия, но уже с короткими концевыми повторами, с нее путем обратной транскрипции синтезируется ДНК-копия с ДКП, которая встраивается в новое место с помощью интегразы.

Интеграция ретротранспозонов с ДКП происходит по механизму, идентичному с нерепликативной транспозицией у прокариот.

Интегразы ретротранспозонов, несмотря на различие в названиях, полностью соответствуют транспозазам.

Рекомбинация у ретроэлементов без концевых повторов менее изучена, но она также осуществляется через РНК-интермедиат.

Другая группа ретротранспозонов – элементы класса I.2 (ретропозоны). Их размер – тоже около 5-6 т. п.н., но на концах они не имеют повторов. На 3’-конце они содержат небольшую последовательность поли-A. Прямых повторов в ДНК-мишени они либо не образуют, либо делают не всегда, и, если делают, то нерегулярной длины. Ретротранспозоны класса II можно разделяют на 2 типа:

LINE (long interspersed nuclear elements) и SINE (short interspersed nuclear elements) – длиной 200-300 п. н., которые не кодируют никаких белков и не способны к самостоятельному перемещению, а перемещаются, по-видимому, за счет элементов LINE.

Механизм перемещения LINE- и SINE-элементов представлен на рисунке. В отличие от ретротранспозонов I типа, здесь реакцию интеграции в хозяйский геном инициируетет РНК-копия элемента. Эндонуклеаза делает ступенчатые ОНР в ДНК-мишени и РНК-копия прикрепляется к концу ДНК-мишени в точке разрыва. На матрице РНК-копии с помощью обратной транскриптазы строится ее ДНК-копия. Свободная группа 3’-OH в точке разрыва используется как праймер для обратной транскриптазы. Потом РНК-копия удаляется с помощью РНКазы H, клеточная репаративная система достраивает вторую цепь ДНК, которая оказывается интегрирированной в реципиентную ДНК. При этом на концах встроенного элемента могут возникать ДПП различной длины.

SINE-элементы не способны к самостоятельной транспозиции и используют соответствующий аппарат LINE.

Рассмотренный процесс принципиально отличается от других механизмов не только транспозиции, но и других типов рекомбинации вообще тем, что здесь не происходит расщепления ДНК на концах элемента и не происходит обмена цепями ДНК.

???70, 71, 72??????

Часто гены экспрессируются последовательно: активация одного гена вызы­вает экспрессию другого или нескольких генов, при­водя в к каскаду событий. Некото­рые гены или родственные группы генов экспрессируются координированно, т. е. отвечают на регуляторный сигнал одновременно и, как правило, в одинаковой степени.

Регуляция экспрессии генов у прокариот

А)Регуляция содержания РНК в процессе биосинтеза

Образование РНК у прокариот чаще всего регу­лируется на уровне инициации транскрипции не­сколькими способами. Первый заключается в модификации структуры РНК-полимеразы. Так, бета-(или бета-прим) субъед. РНК-полимеразы Е. coli изменяется при заражении клеток некоторыми бактериофагами. Другой пример - образование но­вой, сигма-субъед. при споруляции определен­ных штаммов Bacillus. И в том и другом случае изменяются способность РНК-полимеразы к свя­зыванию с промотором и скорость транскрипции соотв-щих генов. Второй способ - изменение пространственной струк­туры ДНК, что влияет на способность РНК-полимераз связываться с определенными промотора­ми и инициировать синтез РНК. И наконец, взаимо­действие РНК-полимеразы с некоторыми промото­рами может ингибироваться или стимулироваться белками, которые связываются с ДНК в месте присоединения полимеразы или вблизи него. На связывание таких регуляторных белков - репрессоров и активаторов - часто влияют определенные метабо­литы, играющие роль корепрессоров и коактиваторов.

Скорость элонгации РНК зависит также от вто­ричной структуры мРНК. Сигналы, которые опре­деляют, дойдет ли транскрипция до конца или закончится преждевременно, играют ключ. роль в рег-ции уровня мРНК. В подобных слу­чаях за прекращ-е или продолж-е транскрип­ции отвечают определ. нуклеотидные после­дов-ти и белки.

В)Согласованная регуляция экспрессии генов

Согласованная регуляция групп родственных ге­нов. У Е. coli гены, кодирующие белки одного и того же метаболического пути или определяющие близ­кородственные функции, часто рег-ся согла­с-но. Это значит, что их экспрессия нач-ся и заканч-ся или согласованно продолжается в ответ на один и тот же регуляторный сигнал. Гены, подчиняющиеся согласованной регуляции, в геноме часто бывают сцеплены и транскриби­руются с промотора, находящегося на 5'-конце та­кой группы генов (кластера), в виде единственной молекулы РНК, называемой полицистронным (или полигенным) транскриптом. Группа координиро­ванно экспрессирующихся генов называется опероном. Три гена, кодирующие ферменты, ответствен­ные за метаболизм галактозы у Е. coli, организо­ваны в оперон с промотором (Р) и примыкающим к нему регуляторным сегментом-оператором (О) на 5'-конце транскрибируемой последовательности: galE-galT-galK. Ген galR, кодирующий репрессор gal-оперона, не сцеплен с опероном.

Гены, кодирующие несколько родственных функ­ций, не всегда образуют единый оперон. Так, гены, кодирующие 30S - и 50S-рибосомные белки, орга­низованы во множественные опероны, в чей состав иногда входят гены, кодирующие другие белки, которые участвуют в транскрипции и/или трансля­ции

Позитивная и негативная регуляция. Негативная регуляция инициации транскрипции, или репрессия, осуществляется белками-репрессорами, которые связываются с операторами. Поскольку последо­вательности оператора и промотора часто перекры­ваются, связывание репрессоров со своими опера­торами ограничивает доступ РНК-полимеразы к промотору, подавляя тем самым инициацию транскрипции. Позитивная регуляция может осущ-ся путем связывания специфических бел­ков с нуклеотидными последовательностями, расположенными в области промотора. Считается, что связанный активаторный белок способствует ассоциации РНК-полимеразы с промотором и, сле­довательно, увеличивает вероятность инициации транскрипции.

Гены, кодирующие регуляторные белки, которые связываются с операторными или активаторными последовательностями, могут находиться как вбли­зи контролируемых ими генов, так и далеко от них. Например, ген, кодирующий репрессор галактозного оперона (galR), не сцеплен с транскрипционной единицей, состоящей из генов galE, galT и gal К. Напротив, позитивная или негативная регуляция транскрипции арабинозного оперона за­висит от того, образуется или нет комплекс между арабинозой и белком, кодируемым только сцеп­ленным с опероном геном ara C.

В) Регуляция экспрессии лактозного оперона

Негативная регуляция. Бактерии Е. coli могут использовать в кач-ве единств. источника углерода и энергии лактозу, поскольку они способ­ны образовывать в большом количестве b-галактозидазу - фермент, расщепляющий лактозу на глюко­зу и галактозу. Однако при росте на других источниках углерода в клетках Е. coli образуется очень мало b-галактозидазы. Ген, ответственный за синтез b-галактозидазы (lacZ), называется индуцибельным, поскольку кодируемый им фермент синтезируется только тогда, когда в клетке присутствуют сахара, имеющие b-галактозильные остатки. Помимо b-галактозидазы, b-галактозиды индуцируют образова­ние еще двух белков: b-галактозидпермеазы (коди­руемой геном lacY), необходимой для проникнове­ния b-галактозидов в клетку, и b-галактозидтрансацетилазы (1ас А), фермента с невыясненной пока функцией. В этих трех генах - lacZ, lacY и lacА - содержится вся информация о белках, коди­руемых lac-опероном. Они транскрибируются в еди­ную полицистронную РНК, при трансляции кото­рой образуются почти одинаковые количества соот­ветствующих белков.

Со структурными генами lac-оперона связаны несколько типов регуляторных элементов,. Промотор-это нуклеотидная последовательность, с которой свя­зывается РНК-полимераза и начинается транскрип­ция трех структурных генов. Оператор-это сайт, с которым связывается lac-репрессор, подавляющий транскрипцию lac-оперона. Ген lac I, не входящий в состав lac-оперона, кодирует репрессор-полипептидную цепь с мол. массой 37000 Да. Репрессор прочно связывается с оператором, находясь в тетрамерной форме.

Поскольку промоторная и операторная после­довательности перекрываются, связывание репрессора с оператором мешает связыванию РНК-полимеразы с промотором, что приводит к блокир-ю транскрипции структурных генов. Транс­крипцию оперона можно индуцировать, если бло­кировать связывание репрессора с оператором. Такое блокирование происходит при свя­зывании одного из b-галактозидов с той или иной субъединицей репрессора, что уменьшает сродство последнего к оператору. После отсоединения реп­рессора от промотора полимераза может связаться с промотором и инициировать транскрипцию опе­рона.

Очень важно сохранение нуклеотидной после­довательности домена lac-оператора, связывающего репрессор. Мутации, уменьшающие сродство репрессора к оператору, приводили к конститутивному синтезу ферментов, кодируемых lac-опероном, т. е. к экспрессии lac-ферментов в отсутствие индуктора. Мутации, сопро­вождающиеся накоплением репрессора в клетках или увеличением сродства репрессора к оператору, делали lac-оперон неиндуцибельным.

Позитивная регуляция. Для экспрессии lac-оперона, как и других индуцибельных оперонов, , необходимо не только снять репрессию оперона, но и получить некий сигнал. Таким сигналом служит комплекс циклического AMP (cAMP) с белком-активатором катаболизма (САР-catabolite activator protein), который связывается со специфической послед-тью, находящейся в самом начале lac-промотора. сАМР, образуется из АТР в ответ на самые разные вне-и внутрикл. события. САР представляет со­бой димер из идентичных полипептидных цепей с мол. массой 22 кДа. Связывание комплекса САР-сАМР со специфической последовательностью в начале промотора приводит к усилению транс­крипции lac-оперона почти в 50 раз. Сам по себе САР не способен к такому связыванию и стимуля­ции транскрипции. Усиление транскрипции с помощью комплекса САР-сАМР можно объяснить тем, что, связываясь с ДНК в непосредственной близости от сайта присоединения РНК-полимеразы, он усилива­ет сродство этого фермента к промотору. Альтернативная гипотеза заключается в том, что связывание САР-сАМР c САР-сайтом предотвра­щает присоединение РНК-полимеразы к располо­женному поблизости слабому промотору и увели­чивает тем самым вероятность того, что полимераза свяжется с «правильным» промоторным сайтом.

Г). Временная регуляция генной экспрессии в жизненном цикле бактериофага l.

У бактериофага l есть два альтернативных способа существования. При литическом пути все вирусн. гены экспрессируются в определ. вре­менной послед-ти, в рез-те чего обра­з. примерно сотня фаговых частиц и происхо­дит лизис инфицированной бактерии. Интегрированная форма вирусн. генома называется профагом. В лизогенных клетках профаговая ДНК многократно реплицируется при помощи клеточн. ап-та так, как будто она является частью клеточного генома. При этом, од­нако, все фаговые гены, кроме одного, выключены.

Литический путь. Гены, кодирующие структурные белки (головки и хвосты), сконцентри­рованы в одной области ДНК; гены, кодирующие ферментативные (репликацию и рекомбинацию) и регуляторные (репрессию и антитерминацию) функции, сосредоточены в другой области генома.

После инфекции фаговая ДНК замыкается в кольцо путем соединения липких концов. Затем РНК-полимераза Е. coli транс­крибирует те фаговые мРНК, которые кодируют белки, необходимые на самых ранних этапах жиз­ненного цикла,- т. н.предранние мРНК. Одна из этих предранних мРНК транс­крибируется справа налево с промотора PL, а тер­минатором служит последовательность tL1. На этой мРНК (L1) синтезируется регуляторный белок N, работающий как антитерминатор. Другая предранняя мРНК транскрибируется слева направо с промотора PR к терминатору tR1 и кодирует только белок Сrо.

По мере накопления белка N происходит аттенуация(ослабление;регуляция транскрипции с помощью сигнала терминации транскрипции, расположенного между промотором и началом первого структурного гена)терминации в tL1 и tR1, РНК-полимераза продолжает транскрипцию через эти сайты с обра­зованием мРНК второго типа - задержанных ранних транскриптов. Более крупный транскрипт, начи­нающийся с промотора PL(L2), коди­рует ферменты, участвующие в рекомбинации, и ферменты, катализирующие встраивание ДНК фага l в ДНК клетки-хозяина. Задержанный ранний транскрипт, начинающийся с промотора PR(R2), кодирует фер­менты, ответственные за репликацию фаговой ДНК (белки О и Р), и еще один регуляторный белок Q. Белок Q вызывает аттенуацию терминации транс­крипции в терминаторном сайте (tR3), расположен­ном сразу за промотором PR'. При транскрипции с промотора PR' транскрибируются гены (S и R), ответственные за включение лизиса клеток. К. т., поскольку ДНК фага l, сразу после инфекции замыкается в кольцо, S- и R-гены оказы­ваются рядом с генами, кодирующими белки голов­ки и хвоста фага. След-но, в рез-те транскрипции, инициир-ной в PR и продолжен­ной через tR3, образуется мРНК, кодирующая белки лизиса и все структурные вирусные белки. Итак, мы рассмотрели образование аппарата, необходимого для литич. инфекции: ферментов репликации вирусной ДНК и вирусных белков, участвующих в формировании зрелых фаговых частиц.

Лизогенный путь. Для того чтобы понять это, нужно усложнить схему строения про­моторов РL, и PR и ввести несколько дополни­тельных генов, генных продуктов и промоторов. На самом деле PL и PR являются частью сложной регуляторной области, в которой промоторы пе­ремежаются с операторными послед-тями OL и OR соответственно. OL и ОR - это сайты связывания двух регулягорных белков: репрессора сI и антирепрессора Сrо. Белок Cro-это продукт трансляции предранней мРНК, транскрибируемой вправо с промотора PR. Репрессор кодируется геном сI, локали­зованным между PR и PL /OL. сI-мРНК транскрибируется в направлении влево от промо­тора PRE, находящегося справа от Cro-гена. PRE сам активируется двумя «позитивными» регуляторными белками, cII и cIII, которые синтезируются после того, как благодаря действию белка N образуются транскрипты мРНК, инициированные в PR и PL, соответственно.

По мере накопления репрессора сI происходит его связывание с левым и правым операторными сайтами, в результате чего подавляется экспрессия всех генов, транскрибирующихся с PR и РL. В этом случае предпочтительным оказывается лизогенный путь, поскольку блокируется образование фермен­тов репликации и структурных вирусных белков, а небольшое количество интеграционного фермента Int, синтезированного с задержанной ранней мРНК, успевает катализировать рекомбинацию между фа­говой и бактериальной ДНК до момента полной репрессии фаговых генов.

Д)Трансляционная регуляция экспрессии некоторых генных продуктов

Синтез белков, составляющих собственно ап­парат трансляции, регулируется на уровне трансля­ции. Гены, кодирующие белки больших (L) и малых (S) субчастиц рибосомы и некоторых белков, участ­вующих в процессе трансляции (в том числе EF-Tu и EF-G), рассеяны по нескольким оперонам. Это позволяет координированно регу­лировать синтез тех генных продуктов, которые должны функционировать согласованно. Экспрессия таких генов как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции происходит координированно. Как мы увидим далее, синтез рибосомных белков частично регулируется также путем изменения со­держания трех рРНК и кинетических параметров процесса сборки рибосом.

Контроль трансляции некоторых оперонов ри­босомных белков осуществляется по одинаковому механизму. Один из рибосомных белков, кодируемый полицистронной мРНК, связывается со специфической последовательностью, локализованной либо на 5'-конце мРНК, либо в начале одной из кодирующих последовательностей в середине мРНК. В обоих случаях это блокирует доступ ри­босом к ближайшей инициаторной трансляционной последовательности. В зависимости от места нахож­дения сайта инициации трансляции мРНК-вблизи 5'-конца кодирующей последовательности или в од­ном из внутренних участков-блокируется трансля­ция всей мРНК или ее части. Контроль по типу обратной связи, при котором продукт регулирует экспрессию собственного гена, называется аутоген­ной регуляцией. Регуляция может осуществляться на уровне транскрипции (например, репрессорный бе­лок сI фага l, регулирует транскрипцию соответст­вующего гена с PRM ) и на уровне трансляции, как в приведенном примере.

При сборке рибосом некоторые из рибосомных белков связываются с рРНК. При наличии достаточного количества рРНК вновь синтезированные рибосомные белки ассоциируют с ней, чтобы инициировать сборку рибосом. При недостатке же рРНК накапливающиеся рибосомные белки связываются с собственной мРНК вместо рРНК и соответственно блокируют собственный синтез и синтез других родственных рибосомных белков. В рез-те предотвращается накопление свободных рибосомных белков. Т. о., некоторые ключевые рибосомные белки-это репрессоры, блокирующие трансляцию кодирую­щей их мРНК. Одновременно они блокируют синтез и других белков, кодируемых той же мРНК. Спо­собность рибосомных белков узнавать как рРНК, так и свою собственную мРНК связана с тем, что обе эти РНК обладают сходными нуклеотидными последовательностями. Так, последова­тельности, в которых рибосомные белки S8 и S7 связываются с 16S-PHK и своими собственными м РНК, имеют сходную вторичную структуру, причем петли имеют идентичные послед-ти.

Вопрос №74

Альтернативный сплайсинг – процесс, позволяющий индивидуальным генам продуцировать множество различных активных белковых изоформ.

Примеры альтернативного сплайсинга:

1) Кальцитонин и белок CGRP - различные пептиды, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга одного гена. Кальцитонин образуется в клетках щитовидной железы и является пептидным гормоном, регулирующим уровень кальция в крови. Белок CGRP – синтезируется в нейронах и является сосудорасширяющим белком, участвующем в формировании вкусовых ощущений.

2) Один из ядерных генов риса продуцирует два совершенно неродственных белка – один является митохондриальным рибосомным белком S14, второй – В-субъединицей митохондриальной сукцинатдегидрогеназы.

Вопрос №75

РНК-интерференция (RNA silensing) – это подавление экспрессии генов у эукариот (замалчивание генов) на посттранскрипционном уровне, индуцированное короткими интерферирующими РНК (small interfering RNA, siРНК).

Появление в клетке dsРНК вызывает каскад событий, известный как РНК-интерференция.

1. Фермент Дайсер связывается с dsРНК и разрезает ей на короткие фрагменты в 21-23 п. н. – siРНК (short interfering RNA).

2. siРНК связываются с ферментативным комплексом RISC (RNA-induced silencing complex), который использует одну её нить (комплементарную мРНК) для связывания с мРНК.

3. Нуклеазная активность комплекса RISC деградирует мРНК.

Основные свойства РНК-интерференции:

•  Специфичность (подавляется экспрессия только того гена, нуклеотидная последовательность которого полностью соответствует нуклеотидной последовательности вводимой dsРНК).

•  РНК-интерференция реализуется на посттранскрипционном уровне (фрагменты dsРНК, соответствующие последовательностям промотора или интрона не вызывали РНК-интерференцию).

•  Эффект РНК-интерференции, возникший в каком-либо участке тела С. elegans может распространяться по всему организму и передаваться по наследству потомкам.

76. Генетическая инженерия – использование методов молекулярной генетики и молекулярной биологии для конструирования in vitro рекомбинантных ДНК (или организмов) с заданными наследственными свойствами.

Задачи генетической инженерии

1.Создание генетических конструкций для изучения фундаментальных научных проблем.

2.Получение биопродуцентов.

3.Создание трансгенных организмов с новыми сочетаниями признаков.

4.Генетическая коррекция. Генотерапия.

5.Сохранение и рациональное использование генофондов.

Методы: Выделение и синтез генов

Модификация генов

Перенос генов

Анализ генов

Анализ продуктов генов

Вопрос №77

РЕСТРИКЦИЯ И МОДИФИКАЦИЯ ДНК (от позднелат. restrictio-ограничение и modificatio - видоизменение), специфич. р-ции метаболизма ДНК в клетках бактерий, обеспечивающие защиту собственной ДНК от встраивания в нее последовательностей ДНК чужеродного происхождения.

Функционирование систем рестрикции (лат. и модификации ДНК основано на след. принципах. С помощью ферментативных р-ций собств. клеточная ДНК специфич. образом модифицируется так, что рестриктазы оказываются по отношению к этой ДНК неактивными. Любая вторгающаяся в клетку чужеродная ДНК отличается от резидентной (собственной) ДНК по специфичности модификации. Это делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестриктаз; разрушению ("рестрикции") подвергаются те молекулы ДНК, к-рые не содержат соответствующих модифицир. элементов.

Роль систем рестрикции-модификации:

n  Заключается в защите клеток от проникновения чужеродной ДНК

n  По сути их роль у бактерий эквивалентна роли иммунной системы высших организмов

Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции) узнают в ДНК специфические для каждого фермента последовательности нуклеотидов и разрезают ее.

Известно три типа рестриктаз, на практике используют рестриктазы типа II.

Рестриктазы типа II узнают и раcщепляют ДНК в строго определенных нуклеотидных последовательностях внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.

Это ключевые ферменты генетической инженерии. В настоящее время известно около 3500 рестриктаз. Из них около 3200 – рестриктазы типа II.

Рестриктазы служат для получения фрагмента или фрагментов ДНК

Для выявления некоторых мутаций в отдельных генах после проведения ПЦР используется метод рестрикционного анализа. В основе метода лежит использование специальных ферментов – рестриктаз. Эти ферменты способны “находить” участки ДНК, в которых может быть локализована мутация, и “расщеплять” их. По количеству и длине фрагментов ДНК, полученных после действия рестриктаз, можно судить о наличии или отсутствии мутации или генетического нарушения в исследуемом гене.

78. Схема типичного эксперимента по клонированию ДНК. Общие принципы конструирования рекомбинантных молекул ДНК.

Клонирование – процесс получения генетически идентичной группы клеток (клонов ), основанный на бесполом размножении одной клетки.

Клонирование – процесс получения генетически идентичной группы клеток (клонов ), основанный на бесполом размножении одной клетки.

Схема типичного эксперимента по клонированию фрагмента ДНК:

1)Получение фрагмента или фрагментов ДНК

2)Конструирование in vitro рекомбинантных молекул (встраивание фрагмента в вектор)

3)Ведение их в клетку

4)Отбор клонов, несущих рекомбинантную молекулу.

Суть конструирования рекомбин. ДНК заключается во встраивание фрагментов ДНК, среди кот. находится интересующий нас участок ДНК, в так называемые векторные мол-лы ДНК (векторы) – плазмид. или вирусные ДНК, кот. могут быть перенесены в клетки про - и эукариот и там автономно реплицироваться. На след. этапе проводится отбор тех клеток, кот. несут в себе рекомбинант. ДНК (с помощью маркерных признаков, кот. обладает сам вектор), и затем индивидуал. клонов с интересующим нас сегментом ДНК (используя признаки или пробы специфич. для данного гена или участка ДНК).

Существует три основных способа встраивания чужеродной ДНК:

1 случай. 3’-концы фрагментов ДНК, среди кот. находится интересующий нас участок ДНК (ген или его сегмент, регуляторный район), с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы наращиваются гомополинуклеотидной последовательностью (например, поли (Т)). 3’-концы линейной формы векторной ДНК тем же способом наращиваются комплиментарной ей гомополинуклеотидной послед-тью (т. е. поли(а)). Это позволяет соединить две молекулы ДНК путем комплементарного спаривания искусственно полученных «липких» концов.

2 случай. «Липкие» концы создаются с помощью расщеплений мол-л ДНК (как вектор., так и содерж. интересующей нас фрагмент ДНК) одной из эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). Рестриктазы высоко специфичны. Они «узнают» в ДНК последоват-ть из нескольких нуклеотидных остатков и расщепляют в них строго определенные межнуклеотидные связи. Поэтому даже в ДНК больших размеров они вносят ограниченное число разрывов.

3 случай. Смесь 1 и 2ого. Когда «липкие» концы ДНК, обр. рестриктазой удлиняются синтетическими последоват-ми.

Концы фрагментов можно превратить в «липкие», наращивая их двутяжевыми олигонуклеотидами («линкерами»), в состав кот. входит участок узнавания рестриктазой. Часто в качестве «линкера» используется полинуклеотидные фрагменты, кот. содержат специф. участки для нескольхих рестриктаз («полилинкер»-сайт множественного клонирования, включает сайты узнавания многих рестриктаз).

После встраивания чужеродной ДНК в вектор, их ковалентное сшивание осущ-тся ДНК-лигазой. Если же размер бреши в рекомбинир. мол-ле больше, чем одна фосфодиэфирная связь, то она встраивается in vitro с помощью ДНК-полимеразы или in vivo с помощью репарационной системы.

Принцип конструирования рекомбинантных молекул:

79. Понятие о векторах. Требования, предъявляемые к векторам. Векторы клонирования. Вектор (векторная молекула) – молекула ДНК, способная переносить чужеродную ДНК и обеспечивать ее поддержание в реципиентных клетках. Природными векторами являются многие плазмиды и вирусы (фаги).Вектор должен:1) Автономно реплицироваться в клетках хозяина; 2)иметь селективный маркер (маркеры); 3)иметь уникальный сайт (сайты) клонирования; 4)не утрачивать способности к автономной. репликации в результате инсерции чужеродной ДНК. + доп. Свойства 5) Стабильно поддерживаться в клетках; 6) Быть многокопийным; 7)быть небольшого размера. + Желательно также иметь сайты рестрикции внутри генов устойчивости к антибиотикам (для плазмидных векторов). Векторы классифицируются на две большие группы: по назначению и по происхождению. К первой группе относится векторы общего назначения и специализированные (векторы клонирования, векторы экспрессии, векторы для секвенирования и др.). Ко второй, плазмидые, фаговые (на основе фага λ, на основе однонитевых фагов), + для клеток животных – векторы на основе эукариотических вирусов: ретровирусов, аденовирусов, вируса герпеса. Векторные системы включают в себя: 1)Вектор переноса генов (“челночный вектор”), 2) Вектор амплификации (увеличение числа копий генов)3) Вектор интеграции(включение в хромосому)4) Вектор экспрессии (увеличение активности гена). В технологии рекомбинантных ДНК клонирование – это использование процедур манипулирования ДНК для получения множественных копий гена или фрагмента ДНК. Клонирование достигается с помощью перемещения фрагмента ДНК в векторную молекулу. Поскольку имеет место клонирование в векторе одного фрагмента ДНК, такую технологию называют МОЛЕКУЛЯРНЫМ КЛОНИРОВАНИЕМ.

№80. Методы введения рекомбинантных молекул в клетки.

1. Трансформация — процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. Иногда под трансформацией понимают любые процессы горизонтального переноса генов, в том числе трансдукцию, конъюгацию и т. д. В любой популяции лишь часть бактерий способна к поглощению из среды молекул ДНК. Состояние клеток, при котором это возможно, называют состоянием компетентности. Обычно максимальное число компетентных клеток наблюдается в конце фазы логарифмического роста. Поглощаемая ДНК должна быть двухнитевой (эффективность трансформации однонитевой ДНК на порядки ниже, однако несколько возрастает в кислой среде), её длина — не менее 450 пар оснований. Для некоторых бактерий поглощаемая ДНК должна содержать определённые последовательности. ДНК необратимо адсорбируются на ДНК-связывающем белке, после чего одна из нитей разрезается эндонуклеазой на фрагменты длиной 2—4 тыс. пар оснований и проникает в клетку, вторая полностью разрушается. В случае, если эти фрагменты имеют высокую степень гомологии с какими-либо участками бактериальной хромосомы, возможна замена этих участков на них. Поэтому эффективность трансформации зависит от эволюционного расстояния между донором и реципиентом. Общее время процесса не превышает нескольких минут. Впоследствии, при делении, в одну дочернюю клетку попадает ДНК, построенная на основе исходной нити ДНК, в другую — на основе нити с включённым чужеродным фрагментом (выщепление).2. Микроинъекции. Принципиальное преимущество микроинъекций в том, что они позволяют эффективно создать трансгенные животные, но их серьезные недостатки: нельзя вводить гены в клетки на более поздних стадиях, в процессе интеграции происходит множество перегруппировок, в геноме оказывается множество копий встраиваемой ДНК, и, наконец, интеграция происходит в произвольное место генома случайным образом. 3. Инфицирование (рекомбинантные фаги и вирусы). ДНК фага встраивается в геном и воспроизводится с каждым циклом репликации. 4. Электропорация. Электропорация – воздействие на клетки электрическим импульсом. При этом в клетках образуются поры, через которые проникает ДНК. 5. Бомбардировка микрочастицами с адсорбированной ДНК. ДНК или РНК преципитируется на микрочастицах золота. Стреляет сжатым гелием, ДНК с носителем находится в микрокапсуле. 6. Липосомы (комплекс ДНК с липидами). Гидрофобная частица, состоящая из двойного слоя липидов, без труда проходит в клетку эндоцитозом. ДНК защищена от разрушения ферментами эндосом. Метод применяется для получения трансгенных животных.

81. Методы получения фрагментов ДНК для клонирования.

ПЦР – это один из методов синтеза определенных последовательностей ДНК in vitro. В реакции используются два праймера, которые гибридизуются (отжигаются) с противоположными нитями и фланкируют последовательность ДНК, которую необходимо амплифицировать. Поскольку фрагмент ДНК, синтезированный в данном цикле может служить в качестве матрицы в следующем цикле, то количество копий заданной последовательности ДНК удваивается в каждом цикле. Повторные серии циклов, включающие денатурацию матрицы, отжиг праймеров и их последующее наращивание с помощью ДНК-полимеразы приводят к экспоненциальному накоплению специфического фрагмента ДНК, концы которого заданы 5’-концами праймеров.

Синтез кДНК (cDNA)Синтез кДНК – это ферментативный синтез двуцепочечной ДНК с использованием в качестве матрицы поли(А)-мРНК.

Первичным субстратом служит биологически активная поли(А)-мРНК, изолированная из эукариотических тканей или культуры клеток и очищенная на олиго (dT)-целлюлозе (афинная хроматография).

Обратные транскриптазы Это РНК-зависимые ДНК-полимеразы у некоторых РНК-содержащих вирусов, которые на матрице геномной РНК синтезируют ДНК-копии РНК. Обычно используют обратные транскриптазы, кодируемые вирусом миелобластоза птиц (AMV) или вирусом лейкемии мышей Малони (MMLV).

№ 82. Получение трансгенных животных.

С помощью микроинъекции ДНК в оплодотворенную одноклеточную яйцеклетку. Рекомбинантную ДНК вводят с помощью микроинъекции в один из пронуклеусов оплодотворенной яйцеклетки. Интеграция трансгена (перенесенного генетического материала) происходит случайно и может привести к нарушению экспрессии генов и быть летальной. Трансген интегрирует только в одну хромосому, поэтому трансгенное животное является гемизиготным. Трансгенные животные как фармацевтические фабрики (биореакторы). Продукция фармацевтически - важного белка (например активатора плазминогена для растворения кровяных тромбов) с молоком трансгенной овцы.Трансгенные быстрорастущие породы лосося были получены введением гена гормона роста под контролем сильного промотора. Все особи одного возраста; вес трансгенных рыб в 11 раз выше веса нетрансгенного контроля.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7