Особенности субпопуляционной архитектоники периферической крови у больных с аутоиммунным миокардитом: клинические и патогенетические аспекты

ОСОБЕННОСТИ СУБПОПУЛЯЦИОННОЙ АРХИТЕКТОНИКИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ С АУТОИММУННЫМ МИОКАРДИТОМ: КЛИНИЧЕСКИЕ И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

З. С. ШОГЕНОВ, К. А. МАЛЬЦЕВ, Е. В. КАЛИНИНА, Н. Н. КЕКЕНАДЗЕ, О. А. ПРОНИНА, П. Х. ДЖАНАШИЯ, Б. В. ПИНЕГИН, М. Е. ЗЕМЦОВА, Т. ЭЛБЕЙК (Т. ELBEIK), Н. В. ГНУЧЕВ, Л. С. МЕТЕЛИЦА (L. S. METELITSA), Ф. Н. ПАЛЕЕВ, СВ. СУЧКОВ

Резюме

Обследовано 99 больных с различными вариантами течения АМ и МКС, и 40 клинически здоровых доноров. При ЗАМ отмечалось увеличение индексов активации Т/В - лимфоцитов, рост экспрессии активационных маркеров на клетках обеих линий дифференцировки, формирование диспропорций в составе иммунорегуляторных субпопуляций с одновременным возрастанием роли ДК, значительное уменьшение интенсивности апоптоза аутореактивных Т-лимфоцитов. При ДАМ выраженных признаков иммунопатологии не обнаружено, в связи с чем данную группу можно рассматривать как самостоятельный вариант течения АМ, требующий индивидуального подхода к разработке патогенетически обоснованных лечебно-реабилитационных мероприятий. Изучение экспрессии активационных маркеров на клетках периферической крови имеет значительные преимущества по сравнению с изучением эндомиокардиальных биоптатов, оснащая врача общей практики, в сущности, неинвазивным методом иммунодиагностики.

Ключевые слова: субпопуляции, миокардит, миокардиосклероз, аутоиммунитет.

Введение

Миокардит часто выступает в роли предвестника сердечной недостаточности (СН) и дилятационной кардиомиопатии (ДКМП) с формированием в итоге локализованного аутоиммунного синдрома [1]. Достигнутый в последние годы прогресс в понимании патогенеза аутоиммунного миокардита (АМ), где ведущая роль принадлежит сочетанным сдвигам в составе клеточного и гуморального звеньев иммунитета, составил основу современных программ лечебно-реабилитационных мероприятий в практике терапевтакардиолога. Циркулирующие в крови субпопуляции, участвующие в формировании того или иного варианта течения АМ, имеют не только патогенетическую, но и клиническую ценность при планировании лечебно-реабилитационных мероприятий. Например, использование такого показателя, как индекс баланса Thl/Th2, может быть полезным при длительном наблюдении за больными с АМ и постмиокардитической ДКМП, позволяя осуществлять контроль за прогрессированием аутоиммунного синдрома. Целью работы являлось сравнительное исследование наиболее значимых параметров субпопуляционной архитектоники крови у больных с различными вариантами течения АМ и миокардиосклероза (МКС) и оценка их патогенетической и клинической значимости в практике.

Материалы и методы исследования

Обследованы 99 больных с различными вариантами течения АМ и МКС и 40 клинически здоровых доноров (ЗД). При диагностике миокардитов использовали классификацию с соавт. (2002) и рекомендации NYHA. Первую группу составили 40 больных со злокачественным течением АМ (ЗАМ), что проявлялось выраженной сердечной недостаточностью (ФК СН 3,0±0,3), высокой частотой встречаемости нарушений ритма и проводимости. Во вторую группу вошли 23 больных с доброкачественным течением АМ (ДАМ) и менее выраженной СН (табл. 1); в третью — 36 больных с МКС, признаком которого считали сохранение в течение 12 и более месяцев после перенесенного АМ изменений ЭКГ органического характера (ФК СН 1,64±0,72 и ФВ 44,7±15,2%). Исследование субпопуляционного состава клеток периферической крови проводили с помощью проточной цитометрии с учетом рекомендаций, изложенных в работах L. Metelitsa, T. Kanda с соавт. и др. Мы использовали как традиционную двухцветную метку, так и комбинации моноклональных антител, меченных пятью различными флуорохромами. Определение иммунологического фенотипа клеток периферической крови проводилось с использованием широкой панели моноклональных антител. В качестве тонирующих моноклональных антител были использованы моноклональные антитела фирм «Протеиновый контур», Coulter Clone (анти-CD14 My-4), DAKO Cytomation (CD3, CD19, CD20 и др.) и Becton-Dickinson (anti-Leu-4 (CD3), anti-TCRgd и др.), а также антитела, полученные от проф. Барышникова (РОНЦ РАМН) и доктора Филатова (Институт иммунологии), зарегистрированные на международном рынке, и антитела, специально приготовленные в зарубежных лабораториях нашими партнерами (напр., CD158a+, CD158b+ и CD2+CD150, CD44+).

Таблица 1

ЗАМ и ДАМ — аутоиммунный миокардит со злокачественным и доброкачественным течением, соответственно.

Оценка результатов проводилась на трех разных типах цитометров. Были использованы: модель FACS Calibur производства фирмы Becton Dickenson (США), модель Cyan фирмы DAKO Cytomation (Бельгия), и модель FACS Scan (Becton Dickinson, США). Положительными считались случаи с экспрессией маркеров, превышающих 20% анализируемой популяции. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием критерия Стъюдента t.

Результаты исследований и их обсуждение

У 40,4% пациентов выявлено злокачественное течение заболевания (ЗАМ). Среди них отмечалось тяжелое общее состояние, чаще встречалась диффузная форма миокардита (М) с хронически рецидивириующим течением (табл. 2, 3), имела место выраженная декомпенсация сердечной деятельности в обоих кругах кровообращения. При ДАМ (23,3%) СН была менее выражена. Вдвое реже наблюдались и опасные для жизни нарушения ритма (табл. 1). При ЗАМ чаще возникали инфекционные осложнения, продолжительность болезни превышала 12 месяцев (табл. 2).

Таблица 2

Клинические особенности заболевания

Таблица 3

Клинические особенности заболевания

Результаты исследований, иллюстрирующие архитектонику субпопуляционных кластеров с эффекторными и регуляторными свойствами у больных с ЗАМ, ДАМ и МКС, представлены в табл. 4.

Таблица 4

Субпопуляционный спектр периферической крови у больных с различными клинико-иммунологическими формами аутоиммунного миокардита

АМ, ДАМ, ЗАМ и МКС - аутоиммунный миокардит, аутоиммунный миокардит с доброкачественным течением, аутоиммунный миокардит со злокачественным течением и миокардиосклероз, соответственно.

Примечание: Различия между показателями больных и здоровых доноров статистически достоверны (* - р<0,001; ** - р<0,05; *** - р<0,01).

Кроме того, при МКС отмечалось менее выраженное, по сравнению с ЗАМ, снижение интенсивности апоптоза Т-лимфоцитов, протекающего по сигнальному пути системы FasL/FasR и менее активное пополнение кластера ДК.

Субпопуляционная патоархитектоника при АМ и МКС: патогенетические и клинические аспекты: Для большинства больных с АМ (в первую очередь, для ЗАМ и МКС) характерна типичная картина аутоиммунного синдрома, затрагивающего эффекторные и регуляторные звенья иммунитета, что подтверждает целый ряд фактов, среди которых ключевое значение для ЗАМ и МКС имеют увеличение индексов активации Т/В-лимфоцитов, рост экспрессии активационных маркеров на клетках обеих линий дифференцировки, формирование диспропорций в составе иммунорегуляторных субпопуляций, значительное уменьшение интенсивности апоптоза аутореактивных Т-лимфоцитов, что согласуется с мнением большинства исследователей, подчеркивающих исключительную значимость механизмов Тh1-зависимой аутоагрессии против миокарда в патогенезе АМ. У больных с ДАМ выраженных признаков иммунопатологии не обнаружено, в связи с чем, данную группу можно рассматривать как самостоятельный вариант течения АМ, требующей индивидуального подхода к разработке патогенетически обоснованных, но иных лечебно-реабилитационных мероприятий. Для АМ, в первую очередь ЗАМ, уже на ранних стадиях характерно существенное повышение содержания в крови ранних активационных маркеров-свидетелей мобилизации ресурсов Т-звена иммунитета, а позднее, аналогичных свидетелей активации В-звена. По мнению ряда авторов, к одним из наиболее значимых в этом плане иммунорегуляторных Т-клеток принадлежат СD4+СD25+-лимфоциты, участвующие в формировании начальных стадий аутоиммунного конфликта при АМ. Возникновение в составе этой группы клеток аномалий ведет к развитию тяжелых аутоиммунных нарушений. Интересной представляется и субпопуляция с фенотипом CD8+CD94+, имеющая тенденцию к динамике при АМ и коррелирующая с целым рядом других субпопуляционных параметров — свидетелей активации ДК и Т-звена иммунитета. Субпопуляцией, способной влиять на процессы реализации физиологических эффектов, являются CD44+CD62L - Т-лимфоциты, несущие рецепторы к комплементу и участвующие на определенных стадиях развития АМ в индукции комплемент-зависимой цитотоксичности и процессах активации и пролиферации аутореактивных к миокарду Т-клеток. Содержание в крови вышеуказанных клеток возрастает в случаях ЗАМ и МКС, коррелируя с ростом других субпопуляций, экспрессирующих активационные маркеры. Существенное место занимает увеличение в крови больных с АМ числа CD45R0+ Т-лимфоцитов, способных прилипать к компонентам микроокружения и выполняющих функции Т-клеток памяти или индукторов Т-хелперов. Обнаруженное нами высокое содержание такого рода клеток в периферическом кровотоке больных с ЗАМ и МКС коррелирует с увеличением плотности клеток указанной субпопуляции в составе воспалительного клеточного инфильтрата, формируемого в очагах поражения сердечной мышцы. Особый интерес вызывают NK-клетки, составляющие гетерогенную популяцию лимфоцитов с широким спектром мишеней для атаки. На фоне стабильной численности определенной части NK-клеток с каноническими фенотипами, отмечено возрастание ряда особых субпопуляций — с фенотипами CD4+CD7CD28-. Не исключено, что именно эти специализированные клетки-киллеры могут являться активным участником событий на самых ранних стадиях развития АМ, фокусируя свой цитотоксический потенциал в зоне воспаления и определяя, в значительной степени, тяжесть заболевания и его неблагоприятный прогноз. В роли партнера NК-клеток на ранних стадиях АМ могут выступать лимфокинактивированные клетки-киллеры (LAK) и субпопуляция с фенотипом CD8+CD28-, способная секретаровать субстанции с цитолитическими свойствами и вызывать активную деструкцию миокарда с формированием ДКМП с переходом в дальнейшем в МКС [13]. Для больных с ЗАМ и МКС отличительной особенностью являются и признаки гиперфункции В-звена, проявляющей себя в увеличении численности зрелых В-лимфоцитов в ряде случаев ЗАМ и МКС, что типично для формирования аутоиммунного синдрома. Обнаруженные нами сдвиги в иммунорегуляторном и эффекторном звеньях иммунитета сочетаются при ЗАМ и, отчасти, МКС с низкими индексами апоптоза циркулирующих в крови Т-лимфоцитов. Вопрос этот изучен недостаточно, в связи с чем анализ коррелятивных взаимосвязей показателей апоптоза лимфоцитов и клинико-патоморфологических особенностей конкретной формы АМ стали объектом интенсивных исследований [14, 15]. В случае ЗАМ одним из важнейших иммунологических критериев прогрессирования процесса является обогащение периферической крови субпопуляциями ДК, гиперфункция которых обуславливает нарушение процессов презентации аутоАГ клеткам иммунной системы, а, в конечном итоге, формирование признаков аутоиммунного синдрома. Четыре важнейших субпопуляции ДК, экспрессирующих функционально активные маркеры CD28,CD80,CD83,CD86 увеличены в крови больных с ЗАМ, провоцируя персистирующую активацию Т-звена. Интерес представляет факт увеличения в крови больных субпопуляций, несущих адгезионные молекулы, участвующих в реализации миграционных свойств клеток и обеспечивающих сложный механизм взаимодействия иммуноцитов с компонентами внеклеточного матрикса и регулирующих, тем самым, характер и интенсивность аутоиммунного воспалительного процесса в очагах поражения миокарда. Среди клеток с адгезионными фенотипами тенденцию к росту у больных с ЗАМ и МКС проявили в разных диапазонах большинство субпопуляций, а через взаимодействие с клетками, экспрессирующих, помимо адгезинов, различные рецепторы к адгезионным и костимуляторным молекулам, возможно осуществлять контроль за миграцией Т-лимфоцитов и макрофагов через эндотелий сосудов, что может играть важную роль в патогенезе ранней фазы АМ. Не исключено, что в ближайшем будущем участие клеток, экспрессирующих молекулы адгезии, в патогенезе АМ станет важнейшей составляющей в создании новой терапевтической идеологии в лечении АМ и других заболеваний аутоиммунного генеза [16]. Прогрессирование АМ и риск хронизации заболевания с трансформацией в ДКМП или МКС зависят от формы иммунопатологии, в том числе, от субпопуляционной архитектоники периферической крови, определяющей, в значительной степени, особенности патогенеза и клиническую картину заболевания. При этом содержание в периферическом кровотоке отдельных субпопуляций и, более того, их комбинации в составе определенных клеточных кластеров обнаруживают коррелятивную зависимость как между отдельными кластерами в пределах анализируемой численности субпопуляционных параметров, так и между кластерами и клинико-иммунологической формой и/или вариантом течения заболевания. При анализе межкластерных взаимосвязей наиболее значимые корреляции установлены в группе с ЗАМ для активационных и костимуляторных маркеров, с одной стороны, и маркеров ДК, с другой. При МКС такого рода корреляция свое значение утрачивает в силу нормализации в кровотоке значительной доли регуляторных субпопуляций с фенотипом ДК. Следует заметить, что для активационных и костимуляторных маркеров и степенью агрессивности основного заболевания (при ЗАМ отмечалось увеличение всех маркеров, а при ДАМ рост ограничился CD8+CD94+) также установлены значимые корреляции. В то же время у больных с МКС, отличающихся по характеру течения от остальных пациентов, в корреляционную группу вошли субпопуляции с иными активационными маркерами, а именно, CD38+, CD69+ и HLA-DR+, динамика которых обнаруживала прямую корреляционную зависимость с другими клиническими параметрами — частотой обострения АМ и развитием экстракардиальных очагов поражения. Не менее существенной является выявленная нами коррелятивная зависимость между содержанием клеток, экспрессирующих активационные маркеры, и клетками с цитотоксическими функциями. Такие корреляции продемонстрированы для клеток с активационными фенотипами CD28+, CD80+ и CD23+, с одной стороны и цитотоксическими клетками с фенотипом CD8+CD94+, с другой, для больных с ДАМ, и для более широкого диапазона клеток с обеих сторон (CD2+CD150+, CD4+CD25+, CD158+a/b, CD3+HLA-DR+, CD14+CD163+) для пациентов с ЗАМ. В группе с ЗАМ обнаружена и обратная зависимость — на фоне роста большинства клеток с активационными фенотипами отмечено снижение числа высокоспециализированных цитотоксических клеток с фенотипами CD57+CD8+, CD8+CD94+, CD8+CD158+. Механизмы цитотоксичности при аутоиммунном синдроме, как известно, имеют решающее значение для прогрессирования АМ и ухудшения сократительной функции миокарда. В этой связи, весьма показательным является еще один пример ассоциативности — при положительной динамике большинства цитотоксических клеток с каноническими фенотипами течение болезни приобретает злокачественный характер в случае активной формы АМ и прогрессирующую форму — в случае МКС. Для клеток с активационными фенотипами HLA-DR+ и CD8+ установлены еще два примера ассоциативности с клинической картиной заболевания — в обоих случаях корреляция затрагивает вышеуказанные субпопуляции, однако, если в группе больных с ЗАМ CD3+HLA-DR+-клетки коррелируют со степенью агрессивности в прямом направлениии, а CD57+CD8+-клетки - в обратном, то у пациентов с МКС корреляционная динамика носит более простой характер - положительная динамика в крови вышеуказанных клеток сопровождается прогрессированием заболевания и развитием экстракардиальных очагов поражения. При ДАМ какие-либо корреляции такого рода нами не выявлены. Существенное значение для лечащего врача имеет обнаруженная нами прямая корреляционная зависимость между степенью агрессивности заболевания в случае ЗАМ и прогрессирования МКС, с одной стороны, и динамикой клеток с фенотипом CD44+CD62L-, определяющих характер межклеточных контактов в зоне воспалительного очага, с другой. При ДАМ такая корреляция отсутствует.

Заключение

Вышеприведенные данные создают объективные предпосылки для развития новых методов иммунодиагностики АМ и его последствий. Изучение экспрессии активационных маркеров на клетках периферической крови имеет значительные преимущества по сравнению с изучением эндомиокардиальных биоптатов, оснащая врача общей практики, в сущности, неинвазивным методом иммунодиагностики, позволяющим осуществлять мониторинг за состоянием иммунной системы пациента и проводить обоснованный подбор терапии.