Особенности клиники и иммунологические нарушения у супружеских пар с бесплодием неясного генеза

На правах рукописи

КЕЛЛЭТ

ЕЛЕНА ПАВЛОВНА

ОСОБЕННОСТИ КЛИНИКИ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ У СУПРУЖЕСКИХ ПАР С БЕСПЛОДИЕМ НЕЯСНОГО ГЕНЕЗА

14.01.01. - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2011

Работа выполнена в 1-ом гинекологическом отделении и лаборатории клинической иммунологии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. Минздравсоцразвития России».

Научные руководители:

доктор медицинских наук Ирина Евгеньевна Корнеева

доктор медицинских наук Анна Владимировна Шуршалина

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Клара Георгиевна Серебренникова

доктор медицинских наук,

профессор Ольга Федоровна Серова

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский Университет Дружбы Народов

Защита диссертации состоится «___»____________ 20___ года на заседании диссертационного совета Д208.125.01 при ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. » Минздразсоцразвития России.

Адрес:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. » Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «___»____________ 20__ года.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Среди множества форм бесплодия, согласно классификации ВОЗ, выделено бесплодие неясного генеза или идиопатическое, когда супружеская пара неспособна к зачатию, однако, современные методы обследования не выявляют причины нарушения фертильности. В структуре бесплодного брака его частота колеблется от 10 до 30%.

Критериями диагностики бесплодия неясного генеза являются фертильная сперма мужа, овуляторная концентрация прогестерона в середине лютеиновой фазы, подтвержденная проходимость маточных труб, нормальный уровень ФСГ в сыворотке крови и отсутствие патологии со стороны органов малого таза [, 2002, Bhattacharya S., 2007, Nakagawa K., 2007].

Этиология БНГ до конца не изучена. Основными направлениями в исследовании причин БНГ за последние несколько лет явились - изучение роли иммунологических, генетических факторов, состояние овариального резерва. Особое внимание уделяют морфофункциональным изменениям в эндометрии как возможной причине нарушения процесса имплантации у данной группы больных [Luborsky J., 2000, Bockos M., 2002, Balasch J., 2002, Putowski L., 2004, Carp H., 2007].

Изучается влияние иммунологических факторов на репродуктивный процесс. Исследователи отмечают, что иммунные нарушения могут быть вовлечены в патогенез бесплодия неясного генеза и вызывать нарушения имплантации эмбриона [Luborsky J., 2000, Balasch J., 2002]. Обсуждается необходимость комплексной оценки состояния иммунной системы у пациенток.

В последние полтора десятилетия было установлено, что в некоторых случаях бесплодие связано с повышенной степенью гистосовместимости супругов по антигенам HLA [, 1997, , 2001, , 2010]. Накопилось много фактов о роли аутоиммунных процессов, имеющих непосредственную связь с системой HLA в нарушении репродуктивной функции. Не вызывает сомнения, что дальнейшее изучение этой проблемы позволит более точно определить значимость и роль совместимости супругов по системе НLA не только при невынашивании беременности, но и у пар с бесплодием неясного генеза.

В настоящее время требуют детального описания и анализа механизмы, связанные с дефектами имплантации у пациенток с бесплодием неясного генеза. На данном этапе развития медицины интерес исследователей сконцентрирован на изучении отдельных факторов, обеспечивающих оптимальную восприимчивость эндометрия в период «имплантационного» окна, нарушение которой может явиться причиной бесплодия у женщин. Изучается роль местных регуляторных факторов в процессе созревания эндометрия на протяжении менструального цикла и имплантации [Glasser S. R. et al., 2002, Klentzeris L. D. et al., 2007].

Таким образом, на современном этапе развития репродуктивных технологий актуальным является дальнейший поиск новых подходов к выяснению этиопатогенеза бесплодия неясного генеза.

Вышеизложенное определило цель настоящего исследования:

оптимизация реализации репродуктивной функции у супружеских пар с бесплодием неясного генеза на основании совершенствования диагностического алгоритма.

Для достижения поставленной цели были сформулированные следующие задачи исследования:

1.  Определить частоту бесплодия неясного генеза. Дать клинико-лабораторную характеристику женщин с бесплодием неясного генеза.

2.  Изучить состояние системного иммунитета у пациенток с бесплодием неясного генеза и проанализировать особенности аутоиммунных нарушений путем выявления частоты встречаемости антител к фосфолипидам клеточных мембран и щитовидной железе.

3.  Провести оценку совместимости супругов по антигенам системы HLA I и II классов.

4.  Оценить иммуноморфологические параметры эндометрия по изучению содержания экспрессии маркеров рецептивности, воспаления, ангиогенеза и апоптоза клеток в ткани эндометрия.

Научная новизна

В результате проведенного исследования определены и проанализированы особенности состояния репродуктивной системы у женщин с БНГ. Проанализирована активность аутоиммунных системных процессов. В результате проведенных исследований установлено, что показатели иммунного статуса оцененного на основании фенотипической характеристики субпопуляций лимфоцитов в периферической крови и количественного определения иммуноглобулинов не демонстрируют каких-либо отличительных особенностей от популяционных данных, в то время как системные аутоиммунные нарушения сопровождают БНГ более чем у 40% женщин.

Проведен анализ встречаемости антигенов системы HLA I и II классов у супружеских пар обследуемой группы. Выявлены маркеры, ассоциированные с аутоиммунными процессами: в I классе - антиген А2; во II классе - аллели 01 и 04 локуса DRB1 и аллели 0201 и 0602-8 локуса DQB1. Установлена высокая частота (60%) совместимости по 3 и более антигенам системы HLA у супругов с БНГ.

Произведена оценка функционального состояния эндометрия в период «имплантационного окна». Впервые у женщин с БНГ изучена экспрессия маркеров LIF, IL-1, VEGF, CAS, принимающих ключевое участие в процессе имплантации. Выявлено, что морфологически неизмененный эндометрий не обладает полноценной функциональной активностью, способной в полной мере обеспечить имплантацию за счет нарушения процессов рецептивности, ангиогенеза, апоптоза.

Практическая значимость работы

В ходе работы определены особенности состояния репродуктивной системы и диагностические критерии бесплодия неясного генеза у женщин. Это позволило предложить расширенный алгоритм обследования для супружеских пар с бесплодием неясного генеза на этапе подготовки к проведению программы ЭКО и ПЭ.

Предложен скрининг маркеров аутоиммунных нарушений, обосновано включение в алгоритм обследования выявление гистосовместимости супругов по системе HLA и необходимость оценки функциональной полноценности эндометрия в период «имплантационного окна» по результатам иммуногистохимического исследования экспрессии маркеров рецептивности, воспаления, ангиогенеза, апоптоза.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1.  Женщины с бесплодием неясного генеза характеризуются сохраненной функциональной активностью гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы, нормальными параметрами овариального резерва и отсутствием патологических изменений со стороны органов малого таза на фоне неизмененных пролиферативно-секреторных процессов в эндометрии.

2.  Бесплодие неясного генеза ассоциировано с аллоиммунными и аутоиммунными нарушениями. Факторами, оказывающими негативное влияние на функциональное состояние репродуктивной системы, являются совместимость по антигенам системы HLA у 60% супружеских пар, а также повышенный уровень антител к щитовидной железе у 47,5% женщин, антител к фосфолипидам клеточных мембран - у 42,5% пациенток.

3. Особенности морфофункционального состояния эндометрия у женщин с бесплодием неясного генеза заключаются в изменении его рецептивности в период «имплантационного окна», что проявляется нарушением экспрессии маркеров имплантации - LIF, IL-1, VEGF, CAS на фоне полноценных пролиферативно-секреторных процессов.

Апробация работы

Основные положения диссертации и результаты работы доложены на межклинической конференции 1-го гинекологического отделения ФГУ «НЦ АГ и П им. » Минздравсоцразвития России 31 марта 2011г. Работа обсуждена на заседании апробационной комиссии ФГУ «НЦ АГ и П им. » Минздрасоцразвития России 16 мая 2011г.

Внедрение результатов исследования в практику

Полученные результаты внедрены в практику работы 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. » Минздравсоцразвития России. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, в т. ч. 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа содержит 26 таблиц, 12 рисунков. Библиографический указатель включает в себя 143 источника, из них 35 отечественных и 108 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Основу работы составили результаты комплексного клинико-лабораторного и эндоскопического обследования 940 женщин с бесплодием, обратившихся в 1-ое гинекологическое отделение ФГУ «НЦ АГ и П им. » Минздравсоцразвития России для лечения.

На первом этапе исследования проведен ретроспективный анализ 900 историй болезни, результаты которого позволили определить частоту бесплодия неясного генеза по данным обращаемости в специализированный гинекологический стационар.

На втором, проспективном этапе в соответствии с поставленными задачами было обследовано 40 пациенток с бесплодием неясного генеза, составивших основную группу исследования.

Критериями включения в исследование являлись: щиеритериями включения в исследование явилось:производили на 21-23 день менструального цикла с помощью кюретки возраст женщин до 35 лет, овуляторный менструальный цикл, отсутствие патологических изменений органов малого таза по данным эндоскопического обследования у женщин (кроме: НГЭ 1 степени, спаечного процесса в малом тазу 1 степени распространения, миомы матки малых размеров - до 2 см субсерозной локализации), нормальная морфологическая картина эндометрия, фертильная сперма мужа.

Контрольную группу для иммуногистохимического исследования эндометрия составили 10 здоровых фертильных женщин репродуктивного возраста, которые не имели гинекологических заболеваний, а также не использовали внутриматочные и гормональные методы контрацепции.

Для диагностики причин бесплодия проведены следующие методы исследования:

1.  Общеклиническое и гинекологическое обследование;

2.  Клинико-психологическое обследование;

3.  Инфекционный скрининг: микроскопия вагинального мазка, окрашенного по Грамму, исследование мазков-отпечатков клеток цилиндрического эпителия цервикального канала для выявления ДНК урогенитальных хламидий, микоплазм, вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ - 2), цитомегаловируса (ЦМВ) с использованием наборов реагентов «ДНК-технологии» (Москва);

4.  Гормональный скрининг: определение концентрации ПРЛ, ФСГ, ЛГ, Е2, тестостерона, ДГЭА-сульфата, прогестерона, ТТГ, Т4св в плазме крови производили радиоиммуннологическими методами;

5.  Оценка сперматогенеза супруга проводилась врачом-андрологом на основании результатов расширенной спермограммы, MAR-теста.

6.  УЗИ органов малого таза проводили на аппарате «Siemens Sonoline-Siena» (Германия) с использованием вагинального датчика 6,5 мгц на 5-7 дни менструального цикла. УЗИ щитовидной железы проводилось при помощи аппарата «Hitachi EUB-405 plus» с линейным датчиком 7,5 МГц.

7.  Овуляторный характер менструального цикла подтверждали с помощью эхографии органов малого таза и определения концентрации прогестерона в плазме крови на 5-7 дни после овуляции;

8.  Иммунологические методы:

- определение уровней аутоантител к ткани щитовидной железы - к тиреопероксидазе (АТ-ТПО) и тиреоглобулину (АТ-ТГ). Исследование осуществляли иммуноферментными методами, набором «Roche diagnostics» (Германия);

- определение уровней антител к кардиолипину, фосфатидилсерину, кофакторам: β2-гликопротеину, протромбину, аннексину V производилась методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческих наборов фирмы ORGENTEC Diagnostika GmbH (Германия) для количественного определения уровней антител классов IgG, IgM;

- фенотипическая характеристика клеток иммунной системы проводилась методом проточной цитофлуометрии с применением моноклональных антител к кластерам дифференцировки CD3, CD4, CD8, CD19, CD19CD5, CD56, CD16CD56 на анализаторе Collibur (Германия);

- концентрацию иммуноглобулинов трех основных классов (G, M,A) определяли в периферической крови методом радиальной иммунодиффузии по Манчини;

9. Иммуногенетические методы:

- исследование антигенов HLA I класса (А, В, С) проводилось на

лимфоцитах периферической крови путем использования стандартного метода «комплементзависимой цитотоксичности», разработанного П. Терасаки (1991). Определение антигенов HLA II класса проводилось методом ПЦР – типирование локусов DRB1, DQB1, DQA1.

11. Эндоскопические: лапаро - и гистероскопию с использованием оборудования фирмы «K. Storz» (Германия) выполняли надень менструального цикла;

12. Морфологическое исследование соскобов полости матки и цервикального канала производили на 7-11 день менструального цикла путем раздельного диагностического выскабливания;

13. Иммуногистохимическое исследование ткани эндометрия проводили в секреторную фазу менструального цикла на 6-8 день после овуляции. Исследовали экспрессию маркеров рецептивности (LIF), воспаления (IL-1), ангиогенеза (VEGF), апоптоза (CAS). Материал для исследования забирали путем аспирационной биопсии эндометрия с помощью кюретки Pipelle de Cornie.

14. Статистическая обработка данных выполнена на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ «Statistica for Windows» v. 7.0, StatSoft Inc. Для непараметрических данных применяли попарное сравнение с помощью критерия Манна-Уитни (для 2-х групп) для несвязанных совокупностей. Статистически значимыми считали отличия при р<0,05 (95%-й уровень значимости).

Исследования одобрены комитетом по этике биомедицинских исследований при ФГУ «НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Результаты исследования и их обсуждения

В соответствии с поставленной целью и задачами исследования для определения частоты БНГ на первом этапе работы мы провели ретроспективный анализ историй болезни 900 женщин с бесплодием. Диагноз «бесплодие неясного генеза» был установлен у 127 женщин. Таким образом, частота данной формы бесплодия по данным обращаемости в специализированный гинекологический стационар составила 14,1%.

Возраст пациенток колебался от 24 до 35 лет и составил в среднем 29,7±4,14 лет.

Анамнез женщин с бесплодием неясного генеза, касающийся перенесенных хронических соматических заболеваний не отличался от пациенток с другими формами бесплодия, подробно охарактеризованными в различных исследованиях [, 2007, , 2010]. Однако обращал внимание тот факт, что 20% из них указали на ранее перенесенные травмы головы, а 15% - на прием наркотических препаратов в подростковом возрасте. Характерными особенностями анамнестических данных женщин с БНГ являлись частые ИППП и воспалительные заболевания половых органов. В структуре ИППП преобладал хламидиоз (50%), почти в 2 раза реже встречался рецидивирующий генитальный герпес (22,5%), в 3 раза реже – трихомониаз (17,5%).

При анализе особенностей репродуктивной функции отмечено превалирование частоты первичного бесплодия (77,5%). Длительность бесплодия составила в среднем 4,13±2,41 года.

Предшествующее неэффективное лечение по поводу бесплодия, включающее проведение КИО и программы ЭКО было ранее проведено у каждой второй женщины.

Результаты гормонального скрининга продемонстрировали, что концентрация ПРЛ, гонадотропных и стероидных гормонов в плазме крови у женщин с БНГ соответствовала нормативным показателям. Средние значение уровня прогестерона в середине лютеиновой фазы составили 43,8 ± 35,8 нмоль/л и указывали на сохранение процесса овуляции у всех обследованных женщин.

По данным УЗИ органом малого таза, проведенного всем 40 пациенткам изучаемой группы, патологических изменений половых органов ни у кого не выявлено за исключением 4 пациенток (10%), у которых в миометрии визуализировалось по одному субсерозному миоматозному узлу диаметром - до 1,5см. Миометрий остальных женщин имел обычную эхо-структуру. Толщина эндометрия соответствовали дню менструального цикла.

Оценке овариального резерва женщин с БНГ уделяют все большее внимание. Для этой цели в настоящем исследовании мы использовали такие общепринятые критерии как: уровень ФСГ, АМГ, объем яичников и число антральных фолликулов. Многие исследователи считают, что женщины с БНГ возможно имеют сниженный овариальный резерв, и это может являться первым признаком недостаточности яичников. Однако, мы не обнаружили изменений параметров овариального резерва. Объем правого яичника у женщин изучаемой группы составил 9,2±3,4 см³, объем левого яичника - 8,3±3,1см³. Число антральных фолликулов в правом и левом яичниках составило 8,8±1,54 и 8,4±1,8 соответственно. Полученные нами данные свидетельствовали о достаточном репродуктивном потенциале яичников.

Лапароскопия является общепринятым стандартом диагностики патологических изменений органов малого таза, способных приводить к бесплодию. С целью оценки состояния органов малого таза всем 40 пациенткам обследуемой группы ранее была произведена диагностическая лапароскопия и гистероскопия с патоморфологическим исследованием эндометрия. Анализ результатов диагностической лапароскопии показал, что у подавляющей части женщин - 55% патологии со стороны органов малого таза не было выявлено. Спаечный процесс в малом тазу I стадии распространения при сохраненной проходимости маточных труб диагностирован у 12,5% пациенток. Исследователи полагают, что поверхностные формы наружного генитального эндометриоза без сопутствующих спаек в брюшной полости и миомы матки малых размеров не являются единственной причиной нарушения репродуктивной функции [Akande U. A. et al., 2004, Nakagawa K. et al., 2007]. В нашем исследовании в ходе проведения эндоскопического обследования наружный генитальный эндометриоз I ст. был обнаружен у 22,5% женщин, cубсерозная миома матки диаметром до 1,5см у 10%.

Патология полости матки и эндометрия была исключена у всех женщин обследуемой группы на основании данных гистероскопии и морфологического исследования эндометрия.

За последние годы накоплено большое число данных, свидетельствующих об участии психосоциальных факторов в возникновении и развитии бесплодия [, 2006]. На фоне патогенетических факторов нарушения репродуктивной функции, как правило, выявляют нарушения эмоциональной сферы. Принимая во внимание не только данные литературы, но и указания 20% пациенток на травмы головы различной степени тяжести, а 15% женщин на прием сильнодействующих препаратов в подростковом возрасте, проведение данного этапа работы представлялось вполне обоснованным. Совместно с психотерапевтом нами было выделено четыре синдромальных типа пограничных расстройств у женщин с бесплодием неясного генеза: тревожно-депрессивный, выявленный у 7 пациенток (17,5%), фобический - у%), истерический – у 8 (20%) и неврастенический - у,5%) женщин. Показатель психосоциального стресса, изученный на основании оценочной шкалы Л. Ридера, продемострировал, что 22 женщины (62,5%) из 40 с БНГ имели высокий уровень психосоциального стресса (от 2,18 до 3 баллов).

Огромный интерес представляет роль иммунных и иммуногенетических нарушений в патофизиологии бесплодия неясного генеза. В связи с этим в литературе обсуждается влияние иммунологических факторов на репродуктивный процесс [Сhoudhury S. R., 2000; Putowski L., 2004]. Согласно теории RAFS (Reproductive Autoimmune Failure Syndrome) «синдрома системных аутоиммунных репродуктивных потерь», аутоиммунные факторы могут приводить к дефектам репродуктивного процесса на различных стадиях [Gleicher N., 1988].

При изучении патогенетических механизмов БНГ исследователи рекомендуют все больше обращать внимание на изучение функции щитовидной железы у данного контингента женщин. Известно, что аутоиммунные заболевания щитовидной железы могут сопровождаться аутоиммунным поражением других систем организма, в том числе и репродуктивной системы [Роррe K., 2008, , 2010]. Чаще всего определяют наличие антител к тиреглобулину (АТ-ТГ) и тиреоидной пероксидазе (АТ-ТПО), наиболее информативно определение титра последних, изолированное носительство АТ-ТГ наблюдается редко и имеет меньшее диагностическое значение. Значение ТТГ у обследованных нами пациенток варьировало от 0,5 до 3,7 МЕ/мл, составило в среднем 1,64±0,9 МЕ/мл и не превышало нормативных показателей. Таким образом, результаты оценки тиреоидного статуса указали на сохранение функции щитовидной железы у всех пациенток изучаемой группы.

Обращали особое внимание высокие титры АТ-ТГ и АТ-ТПО. Средний уровень АТ-ТГ находился в пределах 125,7±309,3 МЕ/мл и колебался от 12,6 МЕ/мл до 1000 Ме/мл, а уровень АТ-ТПО составил 107,7±157,2 МЕ/мл и варьировал от 8,2 МЕ/мл до 542 МЕ/мл. Повышенный уровень АТ - антител выявлен у,5%) из 40 женщин. Носительство АТ-ТПО имели 30% пациенток, АТ-ТГ - 17,5%. УЗИ щитовидной железы было произведено 19 пациенткам с повышенным уровнем АТ-антител. При этом нормальную эхографическую характеристику щитовидной железы имели,9%) из 19 женщин. УЗ признаки аутоиммунного тиреоидита в виде снижения эхогенности ткани, диффузной неоднородности структуры щитовидной железы были выявлены у 8 женщин (42,1%). Объем щитовидной железы у всех 19 пациенток составил в среднем 8,3±1,1см³ и не превышал нормативных значений.

Полученные нами результаты корреспондируют с аналогичными исследованиям других авторов о том, что у женщин с БНГ отмечена высокая распространенность антител к щитовидной железе. Данные антитела являются маркерами дефекта иммунной системы, проявляющегося на системном уровне, и могут являться важным прогностическим признаком репродуктивных потерь.

До настоящего времени остаются нерешенными вопросы о зависимости между циркуляцией антифосфолипидных антител и ранними репродуктивными потерями, однако большинство авторов cклоняются к мнению о том, что повышение уровня последних может быть связано с репродуктивными нарушениями и быть частью генерализованных аутоиммунных нарушений. [Сhoudhury S. R., 2001; Bockos M., 2002]. В проведенном нами исследовании у 17 женщин (42,5%) с БНГ присутствовали антитела к фосфолипидам клеточных мембран, что существенно превышало популяционные значения, соответствующие 2-4% [, 2001]. По полученным нами данным, повышенный уровень антител к фосфатидилсерину класса G и M выявлен у 3 женщин (7,5%) и 7 (17,5%) соответственно. Антитела к кардиолипину класса G были выявлены у 10 пациенток (25%), к кардиолипину класса M - у 7 (17,5%). Антитела к протромбину были обнаружены только у 3 пациенток, причем во всех случаях выявлен повышенный уровень IgG. Уровень IgG к β2-гликопротеину был увеличен у 4 (10%) пациенток, IgM у 5 (12,5%) пациенток. Повышенный уровень антител к аннексину классов G и M отмечался у 2(5%) и 1(2,5%) пациенток соответственно. Волчаночный антикоагулянт не был выявлен ни у одной пациентки.

Таким образом, анализ данных литературы о частоте встречаемости антител к щитовидной железе и фосфолипидов клеточных мембран у пациенток с БНГ свидетельствует в пользу теории RAFS-синдрома о существовании системных иммунных нарушений, препятствующих успешной реализации их репродуктивной функции.

При изучении состояния системного иммунитета у пациенток с бесплодием неясного генеза, оцененного на основании фенотипической характеристики субпопуляций лимфоцитов в периферической крови и количественного определения иммуноглобулинов не имел каких либо отличительных особенностей по сравнению с нормативными показателями.

В настоящее время существуют данные о роли системы HLA в нарушении репродуктивной функции [, 2007]. Установлено, что 70% причин репродуктивных неудач неустановленного генеза могут быть ассоциированы с аутоиммунными нарушениями как у мужчин, так и у женщин [, 2010]. В нашем исследовании мы провели анализ частоты встречаемости генов системы HLA I и II классов.

Показано, что антигены HLA I класса – А2, А10, В15, В18, В40, В41 могут рассматриваться как иммуногенетические маркеры привычного невынашивания неясного генеза [, 2002]. Анализ антигенов системы HLA I класса в данном исследовании продемонстрировал высокую частоту встречаемости антигена А2. Носителями этого антигена являлись 85% женщин и 50% мужчин. Таким образом, мы можем предположить, что превалирующая часть супружеских пар имеет «маркерный» антиген иммунных нарушений.

Одними из главных генов, для которых установлена выраженная связь с развитием аутоиммунной патологией, являются гены HLA класса II, а именно генотип DRB1 и его локусы - 03 и - 04. Также в качестве маркеров предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям следует выделить локусы генотипа DRB1 - 01,- 08,- 09 и – 10. При анализе частоты встречаемости аллелей системы HLA II класса мы обнаружили, что по локусу DRB1 наиболее частыми у 40% женщин явились аллель 01 и аллель 04. Некоторые исследователи рассматривают генотип DQB1, в частности аллели 0201 и 0602-8, ассоциированные с развитием системной красной волчанки и с высоким генетическим риском невынашивания беременности как маркеры аутоиммунных нарушений, ведущих к развитию этих заболеваний [, 2007].

В нашей работе, в локусе DQB1 самым частым как у женщин, так и у мужчин являлся аллель 0602-8 – 62,5% и 50% соответственно. Также у половины женщин встречался аллель 0201. Представленные данные показывают, что в генотипе DRB1 и DQB1 у супружеских пар с БНГ присутствуют антигены, ответственные за развитие аутоиммунных процессов. Таким образом, связь определенных «маркерных» вариантов генов системы HLA с развитием аутоиммунных процессов, очевидно, играет определенную роль в нарушении репродуктивной функции у супружеских пар с БНГ.

Согласно данным литературы последних лет причиной иммунного бесплодия может являться низкий иммунный ответ на аллоантигены партнера из-за сходства по отдельным HLA-локусам. По данным многочисленных исследований, полное несовпадение НLA-генотипов у супругов благоприятно для развития беременности. Совместимость по HLA регистрируется довольно часто, но лишь сходство более 25% расценивается как неблагоприятный фактор в плане наступления беременности [, 1997]. Мы также выявили у супружеских пар совместимости по I и II классам. Согласно полученным в ходе нашей работы данным у 24 супружеских пар (60%) отмечена совместимость по обоим классам системы HLA. Общее количество супружеских пар, имеющих 2 совпадения по двум классам –%). Из них в I классе системы HLA 2 совпадения имели 8 супружеских пар (20%), столько же пар имело 2 совпадения и во II классе. Общее количество пар, имеющих 3 и более совпадений по двум классам системы HLA –%). Их них в I классе 3 и более совпадений имели 4 супружеские пары (10%), во II классе –%). Таким образом, исходя из представленных данных, сходство по 3 и более HLA-локусам у супружеских пар можно расценивать как неблагоприятный фактор для наступления беременности при БНГ.

Крайне важным являлась оценка состояния эндометрия у пациенток с бесплодием неясного генеза с целью выявления возможных механизмов нарушения имплантации. Нами было проведено морфологическое и иммуногистохимическое исследование эндометрия женщин в период «окна имплантации». При световой микроскопии срезов эндометрия, окрашенных гематоксилином эозином, ни в одном из случаев не было выявлено признаков хронического эндометрита. Иммуногистохимическое исследование эндометрия проведено в период «окна имплантации» на 6-8 день после овуляции с использованием маркеров рецептивности, воспаления, апоптоза, ангиогенеза.

С целью оценки рецептивности эндометрия в исследовании применяли маркер рецептивности – LIF (лейкемия-ингибирующий фактор). Этот важнейший модулятор имплантации, оказывая прямое воздействие на трофобластную дифференцировку, опосредует установление «диалога» между эндометрием и эмбрионом. Установлено, что максимальная экспрессия LIF в эпителии эндометрия отмечается в период «окна имплантации» [Simon C. et al., 2001], что позволяет отнести этот фактор к биохимическому маркеру рецептивности эндометрия [Lapre-Delage G. et al., 2002].

В данном исследовании у женщин с БНГ экспрессия LIF в эпителии была снижена и составила 2,5 ± 1,0 баллов, что достоверно отличалась от показателей в группе контроля 3,5±1,07 баллов (p<0,05). В пиноподиях экспрессия маркера также была со статистически значимой разницей относительно группы контроля и составила 2,0±1,8 баллов и 5,2±0,8 баллов (p<0,05) соответственно. В строме эндометрия достоверной разницы в экспрессии LIF между группами не было, но при этом в основной группе экспрессия маркера была ниже показателей группы контроля и составляла 3,13±0,8 баллов и 3,8±1,0 баллов соответственно (рис.1).

Рис.1 Экспрессия маркера LIF в эндометрии (в баллах)

Таким образом, сниженная экспрессия LIF в эндометрии у женщин с БНГ может свидетельствовать о нарушении рецептивности ткани эндометрия и являться важным прогностическим маркером нарушений процессов имплантации на этапе «диалога» между эндометрием и эмбрионом.

Рецептивность эндометрия при иммуногистохимическом исследовании также оценивали по экспрессии маркера воспаления - провоспалительного цитокина IL-1 (интерлейкин-1). Это ключевой регулятор воспалительного ответа. Он является паракринным фактором, который также опосредует связь между эндометрием и эмбрионом в период имплантации [Boucher A., et al., 2001; Castro-Rendon W. A., et al., 2006].

Анализ полученных нами данных выявил статистические различия по сравнению с группой контроля. Так, экспрессия IL-1 в эпителии эндометрия женщин основной группы была существенно ниже, чем в группе контроля и составила 1,59±0,9 баллов и 4,9±0,9 баллов (р<0,05) соответственно. В пиноподиях экспрессия IL-1 в основной группе была также достоверно снижена по сравнению с контрольной и составила 1,2±1,3 баллов и 5,7±0,9 баллов соответственно (р<0,05). В строме эндометрия отмечено статистически значимое снижение экспрессии маркера IL-1 до 2,4±1,7 баллов относительно группы контроля (3,7±0,9 баллов, р<0,05) (рис.2).

Рис.2 Экспрессия маркера IL-1 в эндометрии (в баллах)

Таким образом, экспрессия провоспалительного цитокина IL-1, была значительно снижена в эпителии эндометрия, пиноподиях и строме у женщин с БНГ, что также может явиться одним из факторов, приводящим к нарушению эндометриальной рецепции, и как следствие - нарушение имплантации.

Процесс ангиогенеза в эндометрии оценивали по экспрессии маркера VEGF (сосудисто-эндотелиальный фактор роста). Ангиогенез - важный процесс физиологического моделирования, необходимый для создания состояния рецептивности. Изменение процессов ангиогенеза в эндометрии может привести к неадекватной циклической трансформации эндометрия, нарушению имплантации [Torry D. S., 2007].

Результаты оценки процесса ангиогенеза на основании маркера VEGF в проведенном нами исследовании свидетельствовали о его сниженной экспрессии в основной группе относительно группы контроля. В эпителии эндометрия женщин с БНГ отмечены статистически значимые различия по сравнению с группой контроля – 0,14±0,3 баллов и 0,56±0,4 баллов соответственно (р<0,05). В пиноподиях основной группы экспрессия VEGF также была достоверно снижена и составляла 0,18±0,3 баллов по сравнению с контрольной группой – 0,88±0,4 баллов (р<0,05). В строме эндометрия статистически значимых различий в экспрессии маркера не выявлено, но следует отметить, что в основной группе экспрессия VEGF оказалась значительно ниже группы контроля и составляла 0,32±0,3 баллов и 0,56±0,4 баллов соответственно. Обращало внимание достоверно сниженная экспрессия VEGF в эндотелии сосудов основной группы относительно группы контроля – 0,59±0,2 баллов и 0,94±0,2 баллов соответственно (р<0,05) (рис.3).

Рис.3 Экспрессия маркера VEGF в эндометрии (в баллах)

Анализируя эти данные, мы предположили, что у женщин с БНГ наблюдается неадекватная сосудистая перфузия в тканях, которая, по-видимому, не обеспечивает циклическую трансформацию эндометрия и инвазию трофобласта, что в конечном итоге приводит к нарушению процессов имплантации.

Интенсивность процесса апоптоза при иммуногистохимической реакции оценивали по экспрессии маркера CAS. Апоптоз необходим для нормального протекания стадий адгезии бластоцисты и инвазии трофобласта в ходе физиологической имплантации [Vaskivuo T. E. et al., 2001]. Апоптоз эпителиальных клеток эндометрия индуцируется эмбрионом и является важным механизмом, позволяющим эмбриону преодолеть эпителий эндометрия, в результате чего достигается непосредственный контакт трофэктодермы с базальной мембраной и становиться возможна стромальная инвазия [Simon C.,2001].

В настоящем исследовании экспрессия CAS в строме эндометрия у женщин основной группы была достоверно выше показателей контроля – в 1,4 раза (p<0,05). В эпителии эндометрия экспрессия СAS в основной группе также превышала группу контроля в 1,3 раза (рис.4).

Рис.4 Экспрессия маркера CAS в эндометрии ( в процентах,%)

Полученные нами данные демонстрировали увеличение экспрессии маркера CAS в эндометрии основной группы, что свидетельствовало об интенсивности процесса апоптоза и отсутствии нормальных условий для протекания стадий адгезии бластоцисты и инвазии трофобласта в ходе физиологической имплантации.

Результаты исследования позволили нам сделать вывод о том, что в патогенезе БНГ огромная роль принадлежит генерализованному, многоуровневому аутоиммунному процессу, который вносит свой вклад в развитие репродуктивных нарушений и процесса имплантации. Полученные данные позволяют по-новому оценить состояние репродуктивной системы пациенток с БНГ и взаимосвязь с аутоиммунной патологией на системном уровне и в эндометрии. Несмотря на то, что у всех женщин, включенных в настоящее исследование, эндометрий соответствовал средней стадии секреции, экспрессия маркеров (LIF, IL-1, VEGF), принимающих участие в имплантации оказалась сниженной. Наряду с этим, экспрессия маркера апоптоза CAS в тканях эндометрия была повышена. Полученные данные позволили нам продемонстрировать очевидность вклада нарушений процессов рецептивности, ангиогенеза и апоптоза в патогенез БНГ.

Патогенез БНГ интенсивно изучается и сегодня становится все более очевидным, что под маской «бесплодия неясного генеза» скрывается патологический процесс, в основе которого лежит множественная патология репродуктивной системы. Эффективность преодоления этой формы бесплодия взаимосвязана с более углубленным обследованием супружеской пары, позволяющим оценить особенности иммунной системы, аутоиммунных нарушений, гистосовместимости супругов по системе HLA, а также «готовности» эндометрия к полноценной имплантации.

Выводы

1. Частота бесплодия неясного генеза по данным комплексного клинико-лабораторного и эндоскопического обследования в специализированном стационаре составляет 14,1%. Особенностями преморбидного фона женщин с бесплодием неясного генеза являются перенесенные травмы головы (20%), прием наркотических препаратов (15%), осложненный репродуктивный анамнез (22,5%), ИППП (80%).

2. Иммунологический статус женщин с бесплодием неясного генеза, оцененный на основании фенотипической характеристики субпопуляций лимфоцитов в периферической крови и количественного определения иммуноглобулинов не имеет отличительных особенностей при сравнении с аналогичными показателями фертильных женщин. Системные аутоиммунные нарушения проявляются повышенным уровнем антител к щитовидной железе у 47,5% женщин, антител к фосфолипидам клеточных мембран - у 42,5%, что превышает популяционные показатели в 5 и 10 раз соответственно.

3. В системе HLA выявлены маркеры, ассоциированные с аутоиммунными процессами: в I классе - антиген А2 (у 85% женщин и 50% мужчин); во II классе - антигены DRB1(аллели 01 и 04) – у 40% женщин и DQB1 (аллели 0602-8 и 0201) – у 62,5% женщин и 50% мужчин. Совместимость по 3 и более локусам системы HLA имеют 60% супружеских пар.

4. Эндометрий женщин с бесплодием неясного генеза характеризуется нормальной морфологической картиной и нарушением экспрессии маркеров, принимающих ключевое участие в процессе имплантации. Отражением этих процессов выступает статистически значимое снижение экспрессии LIF в эпителии – в 1,4 раза, пиноподиях – в 2,6 раз, а также снижение экспрессии IL-1 в эпителии – в 3 раза, пиноподиях – в 4,7 раз, строме – в 1,5 раза. Нарушение ангиогенеза проявляется снижением экспрессии VEGF в эпителии – в 4 раза, пиноподиях – в 4,8 раз, эндотелии – в 1,6 раз. В тоже время достоверное увеличение экспрессии маркера CAS в строме в 1,4 раза указывает на интенсивность процесса апоптоза клеток.

Практические рекомендации

Диагностическими критериями «бесплодия неясного генеза» являются: фертильная сперма мужа, овуляторный менструальный цикл, сохраненный овариальный резерв, отсутствие патологических изменений органов малого таза, морфологически неизменный эндометрий по данным комплексного клинико-лабораторного и эндоскопического обследования. Бесплодие неясного генеза также может быть ассоциировано с наружным генитальным эндометриозом I ст. распространения и спаечным процессом в малом тазу I ст. распространения без нарушения проходимости маточных труб. При установлении диагноза «бесплодие неясного генеза» целесообразно расширить алгоритм обследования для выявления:

- гистосовместимости супругов по системе HLA I и II классов;

- аутоиммунных нарушений - антител к щитовидной железе и фосфолипидам клеточных мембран;

- морфофункциональной полноценности эндометрия в период «имплантационного окна» на основании экспрессии LIF, IL-1, VEGF, CAS.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.  Receptivity of endometrium: new aspects in immunology of reproduction / G. T.Sukhikh, A. V. Shurshalina, E. A. Kogan, L. S. Ezhova, Е.Р. Kellet // VI European Congress of Reproductive Immunology, Moscow.-2008.- p.37

2.  , , Шуршалина неясного генеза: фокус современных научных исследований // Проблемы репродукции.- 2010.- №1.- С. 32-35

3.  , , Корнеева эндометрия в неудачах реализации репродуктивной функции // Проблемы репродукции.- 2010.- №2.- С. 16-20

4.  Морфофункциональная характеристика эндометрия у женщин с бесплодием неясного генеза / , , // Проблемы репродукции.- 2011.- №3.- С. 26-30.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМГ – антимюллеров гормон

АТ-ТГ – антитела к тиреоглобулину

АТ-ТПО – антитела к тиреопероксидазе

БНГ - бесплодие неясного генеза

Е2 - эстрадиол

К - кортизол

ЛГ – лютеинизирующий гормон

НГЭ - наружный генитальный эндометриоз

П – прогестерон

ПРЛ - пролактин

ПЭ - перенос эмбрионов

Т – тестостерон

Т4св. – тироксин свободный

ТТГ – тиреотропный гормон

УЗИ – ультразвуковое исследование

ФСГ – фолликулостимулирующий гормон

ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение

LIF – лейкемия ингибирующий фактор

VEGF – сосудисто-эндотелиальный фактор роста

IL-1 – интерлейкин-1

RAFS - синдром системных аутоиммунных репродуктивных потерь