Иммунологические аспекты перинатальной патологии у недоношенных детей

УДК 616-053.32/.34-091:612.017.11 На правах рукописи

Иммунологические аспекты перинатальной патологии у недоношенных детей

14.00.36 – аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Алматы, 2010

Работа выполнена в РГП Казахский Национальный медицинский университет имени Министерства здравоохранения Республики Казахстан

Защита состоится « 21 » октября 2010 года в 13:00 часов на заседании объединенного диссертационного совета ОД 09.16.01 при Научном центре гигиены и эпидемиологии имени Хамзы Жуматова МЗ РК, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра гигиены и эпидемиологии МЗ РК, 4.

Автореферат разослан « 17 » сентября 2010 г.

Ученый секретарь объединенного

диссертационного совета,

доктор медицинских наук

Важность комплексного изучения адаптационных возможностей для своевременного выявления нарушений равновесия и взаимосвязи иммунных механизмов при патологическом процессе у недоношенных детей позволит качественно и количественно оценить уровень значимости отдельных позиций и определить новые подходы к диагностике перинатальной патологии [T. C. Darvill, 2009; , 2007]. При этом серьезной проблемой при изучении иммунных нарушений является отсутствие четкого представления о возрастной «условной» норме показателей иммунологической реактивности недоношенных детей, присущих различному гестационному периоду. Во многих работах, недоношенные новорожденные, родившиеся при сроке 28-37 недели гестации, как правило, объединяются в одну возрастную группу и интерпретация становления иммунных механизмов у этих детей весьма приблизительное и нередко разноречивое [, 2002; S. Allan, 2002; , 2001]. Помимо того, работы [M. G. Hava, 2004; М. Rodriguez, 2001], касающиеся изучения иммунореактивности глубоконедоношенных детей с перинатальной патологией, родившихся до 28 недели гестации, носят фрагментарный характер, а информация, представленная в них, зачастую мало информативна.

Проблемным вопросом также является лабильность иммунологических показателей, зависящих не только от гестационного возраста, вида патологии, преморбидного фона, но и от генетических факторов. Известно, что для многих заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды. Исходя из современных представлений о механизмах развития перинатальной патологии, одним из наиболее прогрессивных подходов является определение генетических маркеров развития патологии у плода и новорожденного для ранней диагностики и прогнозирования течения заболевания в периоде новорожденности. Следует отметить, что в доступной литературе отсутствуют данные по исследованиям и поиску полиморфных маркеров в генах-кандидатах с последующей оценкой индивидуального генетического риска реализации перинатальной патологии у недоношенных новорожденных.

Кроме того, недостаточно освещены вопросы динамики восстановления функциональной активности иммунной системы у недоношенных с перинатальной патологией и возможности прогнозирования исходов патологии в постнеонатальном периоде жизни ребенка [, 2008; , 2005; Y. Murata et al, 2005; К. Ballanyi, 2004; , 2004].

Таким образом, необходимость изучения и решения вышеуказанных проблем, обеспечивают актуальность настоящей темы, приоритетность ее цели и задач.

Цель: определить роль иммунной дисфункции в патогенезе перинатальной патологии у недоношенных детей различного гестационного возраста на основе изучения закономерностей становления иммуноцитокиновой регуляции и ее нарушений в целях совершенствования диагностики и прогнозирования течения постнеонатального периода жизни, а также обоснования соответствующих рекомендаций по совершенствованию профилактических и лечебных мероприятий.

В процессе реализации данной цели решались следующие конкретные задачи:

1.  Изучить онтогенетические особенности иммунного гомеостаза у недоношенных детей различного гестационного возраста.

2.  Дать комплексную клинико-иммунологическую характеристику состояния недоношенных детей с различными видами перинатальной патологии: перинатальной энцефалопатией, респираторными нарушениями и задержкой внутриутробного развития.

3.  Оценить диагностическую и прогностическую информативность показателей иммунно-цитокинового статуса недоношенных детей с перинатальной патологией с учетом гестационного возраста.

4.  Выявить особенности иммунологической реактивности у недоношенных детей при хроническом течении внутриутробной цитомегаловирусной инфекции.

5.  Определить ассоциацию полиморфизма аллельных вариантов генов цитокинов и их рецепторов у недоношенных детей с внутриутробной цитомегаловирусной инфекцией.

6.  Обосновать иммунологические индикаторы прогнозирования течения постнатального периода жизни у недоношенных детей с перинатальной патологией.

Научная новизна

Впервые на основе комплексного анализа большой совокупности иммунологических данных охарактеризованы особенности иммунного статуса «условно» здоровых недоношенных детей 22-27, 28-33 и 34-36 неделях гестационного возраста.

Впервые установлено, что уровни продукции иммунных медиаторов IL-1β, IFN-γ, IL-2 и IL-10 являются значимыми маркерами нарушений иммунологической регуляции при церебральной, респираторной патологии и задержке внутриутробного развития у недоношенных детей и могут использоваться для диагностики и прогнозирования течения заболеваний в постнатальном периоде (инновационные патенты РК на изобретение № 000.1; № 000.1; № 000.1).

На основе выявленных изменений в иммунном статусе недоношенных детей с перинатальной патологией определены иммунологические критерии прогнозирования течения постнатального периода у указанной категории детей в первый год жизни (инновационный патент на изобретение РК № 000.1).

В результате проведенных исследований установлено, что иммунологические нарушения при перинатальной патологии имеют дифференциальные отличия в зависимости от гестационного возраста недоношенного ребенка и проявляются: субкомпенсированным нарушением иммунного статуса, выявленном при сроке 34-36 недели гестации; нарушенным компенсированным состоянием, характерным для 28-33 недели гестации; декомпенсированным нарушением иммунного статуса, определенным в сроке 22-27 недели гестации.

Впервые установлены варианты иммунных сдвигов при хроническом течении внутриутробной цитомегаловирусной инфекции, являющиеся критериями выделения гипо - и гиперреактивного видов иммунного ответа у недоношенных детей.

Впервые проведено изучение распределения полиморфизма аллельных вариантов генов IL-1Ra (rs4251961), IL-2Ra (rs) и IL-10 (rs1800896) у «условно» здоровых недоношенных детей и недоношенных детей с внутриутробной инфекцией. Установлено, что гомозиготный вариант генотипа А/А полиморфного локуса rs1800896 гена IL-10 ассоциирован с низким уровнем продукции IL-10. Для гомозигот по аллелям А rs гена IL2Ra выявлен риск развития гиперрецепции IL-2Ra, в сравнении с гомо - и гетерозиготами по аллелям G. Доказано, что генетически обусловленная дисрегуляция продукции IL-10 и рецепции IL-2Ra у недоношенных детей с хроническим течением внутриутробной цитомегаловирусной инфекции приводит к разнонаправленным изменениям в виде снижения или повышения иммунной реактивности.

На основании проведения мониторинга показателей иммуно-цитокинового профиля при катамнестическом наблюдении недоношенных детей с перинатальной патологией в постнатальном периоде предложен алгоритм диспансерного наблюдения.

Практическая значимость

Предложены комплексные диагностические и прогностические клинико-иммунологические критерии оценки состояния здоровья недоношенных детей различного гестационного возраста.

Обоснована необходимость комплексного подхода к оценке иммунного статуса недоношенных детей, позволяющая адекватно оценивать характер, глубину и динамику патологического процесса. Установленные изменения концентрации свободных цитокинов в сыворотке крови позволяют оценить тяжесть и характер течения патологии у недоношенных детей и рассматривать их в качестве диагностических и прогностических маркеров патологического процесса.

Уточнены патогенетические механизмы формирования таких видов перинатальной патологии, как задержка внутриутробного развития, церебральной и респираторной патологии, разработан и используется алгоритм диагностики перинатальной патологии в практике амбулаторно-поликлинических служб (инновационный патент на изобретение РК № 000.1).

Выявление ассоциации полиморфных локусов rs1800896 гена IL-10 и rs гена IL2Ra открывает новые перспективы в прогнозировании течения хронической внутриутробной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных детей.

Материалы исследования дают основание для проведения ранней, комплексной и более объективной диагностики патологических состояний у недоношенных детей с прогностической оценкой исходов патологии. Практическую значимость для неонатологов, педиатров, неврологов, организаторов здравоохранения имеют:

- разработанный метод диагностики церебральной ишемии на основе показателей цитокинового статуса у недоношенных новорожденных, позволяющий неврологам определить тактику ведения, прогнозировать неврологические и соматические исходы заболевания и степень восстановления утраченной функциональной активности ЦНС (инновационный патент на изобретение РК № 000.1);

- выявленные особенности иммунно-цитокинового профиля у недоношенных новорожденных с внутриутробной пневмонией позволяют педиатрам разработать индивидуальные схемы наблюдения и профилактики заболеваний у указанного контингента детей (инновационный патент на изобретение РК № 000.1);

- предложенный способ оценки неонатальной адаптации недоношенных детей, рожденных с задержкой внутриутробного развития, позволит педиатрам провести коррекцию в терапии (инновационный патент РК № 000.1).

Основные положения, выносимые на защиту

1.  Онтогенез иммунно-цитокиновой системы недоношенного ребенка характеризуется выраженной лабильностью показателей при различных сроках гестации. Так, иммунный статус недоношенных детей 28-33 недели гестации в сравнении с показателями недоношенных детей 22-27 недели и 34-36 недели гестации отличается интенсивностью сдвига показателей в сторону нарастания CD4+, CD8+-лимфоцитов, CD25+ и CD95+ клеток, сопряженностью соотношений IFN-γ/IL-10, IL-2/IL-10. Данный факт позволяет характеризовать период гестации в 28-33 недели развития как «критический» для недоношенного ребенка.

2.  При однотипности дизрегуляции таких клеточных параметров, как снижение CD4+ и CD25+- лимфоцитов, сочетающееся с повышением CD20+- и CD95+-клеток, наиболее информативными дифференциально-диагностическими критериями для каждого вида перинатальной патологии являются уровни цитотоксических клеток (CD8+, CD16+) и цитокинов. Так, для перинатальной энцефалопатии – это значительное присутствие цитотоксических клеток с нарастанием продукции IL-2, IL-1β и снижением IL-10; при респираторной патологии в качестве диагностического критерия выступают высокий уровень продукции IL-2 и IFN-γ при сниженном содержании естественных киллеров (CD16+) и концентрации IL-10; для задержки внутриутробного развития – дефицит цитотоксических клеток и угнетение продукции IL-2, IFN-γ на фоне подъема уровней IL-1β и IL-10.

3.  Степень иммунологических нарушений при перинатальной патологии у недоношенных детей обусловлена гестационным возрастом. У недоношенных детей со сроком гестации 34-36 недели выявлены «субкомпенсированные» нарушения иммунного статуса, определяемые снижением цитотоксических показателей и активацией гуморального звена иммунной системы и клеточных факторов неспецифической резистентности организма. Для недоношенных детей 28-33 недели гестации характерно «нарушенное компенсированное» состояние, проявляющееся гипоиммуноглобулинемией, снижением активности микрофагоцитарной системы на фоне восстановленного клеточного (повышение CD3+- и CD8+-клеток) иммунитета. Выявленный комбинированный дефицит регуляторной, гуморальной и интерфероновой составляющей иммунитета у недоношенных детей 22-27 недели гестации свидетельствует о декомпенсированном состоянии иммунной системы.

4.  Выявленные особенности иммунных нарушений у недоношенных с хроническим течением внутриутробной цитомегаловирусной инфекции составили основу для разработки двух вариантов проявления иммунного ответа: гипо - и гиперреактивного. Одной из главных причин дисрегуляции иммунного ответа у недоношенных детей с хроническим течением ЦМВИ является ассоциация полиморфных локусов rs1800896 гена IL-10 и rs гена IL2Ra с уровнем выработки противовоспалительного цитокина IL-10 и рецепции СD25+, рецептора для провоспалительного цитокина IL-2.

5.  Наличие дисбаланса иммунологических показателей при перинатальной патологии является «пусковым моментом» в формировании дизадаптации, хронизации соматических и психосоматических заболеваний у недоношенных детей на первом году жизни.

Внедрение полученных результатов в практику

Результаты проведенных исследований по диагностике степени тяжести перинатального гипоксического поражения ЦНС, прогнозирования течения и исходов заболевания применяются в клинической работе неонатологов и педиатров городских родильных домов №1 и №5, родильного дома городской клинической больницы №1 (г. Алматы), отделений патологии новорожденных городского перинатального центра (г. Алматы), областных перинатальных центров (г. Кызылорда, г. Шымкент, г. Петропавловск), детских отделений городских поликлиник №1, № 4, №8, № 11, № 17 (г. Алматы).

Разработанный способ диагностики внутриутробной инфекции в составе комплексного обследования недоношенных детей в раннем неонатальном и в постнеонатальном периоде используется неонатологами и педиатрами областной детской клинической больницы №1 (г. Петропавловск), в отделениях городского перинатального центра и детских отделений городских поликлиник (г. Алматы).

Алгоритмы выделения недоношенных новорожденных в группу риска по задержке внутриутробного развития внедрены в практическую работу неонатологов и педиатров областного перинатального центра (г. Петропавловск), городского родильного дома (г. Кызылорда), городских родильных домов №1 и №5, городского перинатального центра, родильного дома городской клинической больницы №1 (г. Алматы).

Материалы данного исследования включены в программу обучения по педиатрии для студентов и клинических ординаторов кафедры детских болезней лечебного факультета с курсом неонатологии Казахского национального медицинского университета им. и городского медицинского колледжа (г. Кызылорда).

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: IV Международной конференции детских неврологов Центрально-Азиатских стран «Мост между Европой и Центральной Азией – профилактика детской неврологической инвалидности в Казахстане» (Алматы, 2007); V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007); Международном конгрессе «Гастроэнтерология - 2007» (Алматы, 2007);Республиканской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной теоретической, клинической медицины и медицинского образования», посвященной 50-летию Западно-Казахстанской государственной медицинской академии (Актобе, 2007); III съезде врачей и провизоров Республики Казахстан (Астана, 2007); I Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты клинической микробиологии» (Алматы, 2007); Международной научной конференции, посвященной 110-летию СПбГМУ им. академика (Санкт-Петербург, 2008); Республиканской научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологической педиатрии: вчера, сегодня, завтра» (Алматы, 2008); Международной конференции «Педиатрия: проблемы и перспективы развития» (Алматы, 2008); Международной конференции «Педиатрия: пути совершенствования медицинской помощи» (Алматы, 2009); XIV International Scientific conference «Family health in the XXI – century» (Rimini, Italy, 2010); I Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010); Научно-плановой проблемной комиссии КазНМУ имени «Научные основы эпидемиологии, иммунологии, микробиологии, инфекционных и неинфекционных процессов (этиопатогенез, диагностика, лечение, профилактика, разработка новых подходов)», 6 мая 2010 года; Ученом совете НЦГиЭ им. Х. Жуматова МЗ РК 18 июня 2010 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 37 научные работы, из них 18 – индивидуальных, 8 в зарубежных изданиях, 1 монография и 15 в рецензируемых научных журналах перечня Комитета по контролю в сфере образования и науки МОН РК. Получены 4 инновационных патента РК на изобретение (№ 000/0404.1, № 000/0405.1, № 000/0496.1, № 000/0846.1).

Связь с планами научно-исследовательских работ

Диссертация является фрагментом целевой научно-исследовательской программы Казахского национального медицинского университета им. МЗ РК (ГРНТИ - № 76.29.50.76.29.48) «Роль внутриутробных инфекций в перинатальной патологии матери и ребенка и обоснование мер по их снижению» (руководитель программы д. м.н., профессор ).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 141 отечественных и 112 иностранных источника. Работа иллюстрирована 25 рисунками, 43 таблицами.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Общая программа проведенных исследований включала несколько этапов, направленных на решение задач, позволяющих раскрыть роль перинатальной патологии в становлении иммунно-цитокинового статуса у недоношенных детей.

Материалы исследований

Клинические наблюдения и исследования проводились в городских родовспомогательных учреждениях №1, №5, перинатальном центре, родильном доме городской клинической больницы №1, иммунологической лаборатории «Иммунотест» (зав. лаб. – д. м.н., профессор ). В неонатальном периоде и в течение первого года жизни недоношенные дети наблюдались в детских отделениях городских поликлиник г. Алматы (под патронажем д. м.н., профессора ).

Источниками клинических данных явились: «Обменная карта беременной» (ф. ), «История родов» (ф. №96-у), «История развития новорожденного» (ф. ), «Медицинская карта ребенка» (ф. ), «Медицинская карта стационарного больного» (ф.), а также протоколы патоморфологического исследования плаценты и журналы учета плацент.

Критериями исключения из исследования были: доношенные новорожденные (рожденные на 37-42 неделе беременности); наличие множественных врожденных пороков развития (МВПР); врожденной эндокринной патологии; новорожденные, которым проводили переливание компонентов крови до забора крови на иммунологическое исследование.

Первый этап исследований был направлен на анализ причин, приведших к преждевременным родам у женщин с патологическим течением беременности, в результате чего был проведен проспективный анализ 325 историй родов женщин и истории рождения недоношенных новорожденных в период с 2007 по 2010 годы. Обследовались роженицы с преждевременными родами с одноплодной беременностью при сроке гестации от 22 до 36 недель включительно. Проводился анализ факторов риска развития перинатальной патологии, клиническое обследование всех недоношенных новорожденных, включающее сбор и анализ данных анамнеза, паритета и течения беременности, описания особенностей настоящих родов.

Второй этап исследований заключался в анализе частоты рождения и особенностей неонатального периода адаптации недоношенных новорожденных детей. Из 325 обследованных недоношенных детей в физиологическом отделении родилось ,9%) новорожденных и в обсервационном - ,1%) ребенка. По половому различию дети распределились следующим образом: 158 мальчиков, что составляло 49% от общего количества обследуемых новорожденных и %) девочек. В зависимости от клинического течения периода адаптации недоношенные новорожденные были разделены на следующие качественно различающиеся группы:

I группа – недоношенные дети с благоприятным исходом в неонатальном периоде - «условно» здоровые (%). Результаты обследования детей (общий анализ крови, мочи, биохимические показатели крови, ИФА, ПЦР) позволили исключить наличие патологического процесса. В зависимости от гестационного возраста недоношенные новорожденные были разделены на три подгруппы: Ia - недоношенные новорожденные дети (n=10), рожденные при сроке 22-27 недель гестации; Ib - недоношенные новорожденные дети со сроком 28-33 недели гестации (n=38); Ic - недоношенные новорожденные дети со сроком 34-36 недели гестации (n=57). «Условно» здоровые недоношенные дети 34-36 недели гестации в дальнейшем составили контрольную группу сравнения. Сроки гестационного возраста определялись в соответствии с «Оценкой гестационного возраста ребенка по совокупности морфологических критериев» (Ballard, 1979).

II группа – недоношенные дети (%) с наличием клинических синдромов соматической патологии перинатального периода, которые были разделены на три подгруппы: IIa - составили (n=96) недоношенные дети с преобладанием перинатальной патологии центральной нервной системы; IIb - недоношенные новорожденные (n=82) с выраженной респираторной патологией; IIc - недоношенные новорожденные (n=42) с диагностированной задержкой внутриутробного развития при рождении. Возрастная и половая характеристика недоношенных детей представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Количественная характеристика недоношенных новорожденных с учетом гестационного возраста

На третьем этапе по результатам проведенных исследований у недоношенных детей из II группы выделена III группа, куда вошли 75 недоношенных новорожденных с диагностированной внутриутробной цитомегаловирусной инфекцией, что составило 34% случаев. Так, при сроке 22-27 недели гестации инфицированы,3%) недоношенных, при сроке 28-33 недели%) детей и при сроке 34-36 недели,7%) недоношенных. Количество детей по наличию или отсутствию ВУИ представлено в таблице 2.

Таблица 2 – Количественная характеристика недоношенных новорожденных с реализацией ВУИ и без ВУИ с учетом гестационного возраста

Заключительный этап исследований состоял в выявлении иммунологических индикаторов прогнозирования течения постнатального периода жизни, для чего было проведено катамнестическое наблюдение 24 «условно» здоровых недоношенных детей и 43 недоношенных детей с перинатальной патологией в динамике первого года жизни.

Методы исследования

Клиническое наблюдение за недоношенными новорожденными осуществлялось по общепринятой схеме. Были проведены: оценка состояния ребенка по шкале Апгар на 1 и 5 минутах жизни, оценка морфофункциональной зрелости по шкале Ballard (1977), оценка тяжести синдрома дыхательных расстройств по шкале Silverman (1968), первичное описание клинического статуса ребенка, оценка органной недостаточности по шкале (2002). Кратность оценки состояния недоношенных детей в сутки составляла 2-4 раза. Клинико-лабораторные исследования проводились по стандартным методикам согласно требованиям медико-экономического протокола, утвержденного Министерством здравоохранения РК в регламентированные периоды наблюдения.

Методы диагностики внутриутробных инфекций. Диагноз внутриутробной цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) основывался на анамнестических и клинических данных и подтверждался обнаружением специфических антител в иммуноферментном анализе (ИФА) и генома возбудителей в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Исследование популяционного состава лимфоцитов крови. Анализировалась лейкоцитарная формула. Для определения иммунологических показателей забор пуповинной крови производился в количестве 7-10 мл (5 мл с гепарином и 5 мл без гепарина). Лимфоциты выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин р=1,078 г/мл ( 1998). Количественное определение субпопуляционного состава лимфоцитов крови проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием панелей моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным антигенам лимфоцитов: общие зрелые Т-лимфоциты (CD3+), Т-лимфоциты хелперы (CD4+), Т-лимфоциты киллеры (CD8+), естественные киллерные клетки (CD16+), В-лимфоциты (CD20+), лимфоциты, несущие рецептор к IL-2 (CD25+), лимфоциты, несущие Fas-рецептор (CD95+). Концентрации цитокинов и иммуноглобулинов определяли иммуноферментным методом наборами реактивов производства -Бест» (г. Новосибирск). Функциональная активность нейтрофильных фагоцитов исследовалась в тесте восстановления нитросинего тетразолия - НСТ-тест по методу B. N.Park et al. (1969).

Генетическое исследование венозной крови. Генотипирование однонуклеотидных замен в генах IL-1Ra (rs4251961), IL-2Ra (rs) и IL-10 (rs1800896) проводили с помощью ПЦР в режиме реального времени (ПЦР - real time) с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК. Детекцию продуктов ПЦР - амплификации в количественном варианте осуществляли при помощи прибора «iQ iCycler» (Bio-Rad, США), согласно рекомендации производителя тест-систем. Каждый образец амплифицировался с использованием пары праймеров и двух зондов, несущих «гаситель» на 3’-конце и разные флюоресцентные красители (FAM либо R6G) на 5’-конце. Структуры праймеров и зондов приведены в таблице 3.

Таблица 3 – Структуры праймеров и зондов, используемых для генотипирования в режиме реального времени методом конкурирующих TaqMan-зондов

Статистическая обработка результатов исследований проведена с использованием пакетов прикладных программ Microsoft Office Excel, Statistica-6,0 и SPSS версии 11,5 для Windows. Для анализа данных применялись методы многомерной статистики, линейного корреляционного, дискриминантного, кластерного анализов. Достоверность полученных результатов оценивалась по критерию Стьюдента, при наличии существенных различий между сравниваемыми величинами (p<0,05 или p<0,01).

Результаты исследований и их обсуждение

В соответствии с поставленной целью работы и решения задач проводилось исследование, которое включало анализ клинических данных и показателей иммунно-цитокинового статуса по качественно выделенным группам.

Анализ состояния здоровья недоношенных новорожденных I группы.

105 недоношенных детей родились от матерей с экстрагенитальной патологией, у которых не выявлены возбудители TORCH-инфекций. Настоящая беременность была первой у 43,8% женщин, повторной (2-11) у 56,2%. Роды были первыми у 46,7% женщин, повторными (2-4) - у 53,3%. В структуре неблагоприятных факторов течения беременности доминировал (78,1%) отягощенный акушерский анамнез (ОАА), где основное место занимали самопроизвольные аборты, выкидыши, неонатальная смерть предыдущих детей; угроза прерывания беременности (51,6%), гестозы и анемия беременных (53%). Продолжительность безводного промежутка у всех рожениц данной группы была не более 9 часов, лишь в одном случае - 14 часов. Средняя продолжительность безводного промежутка составила 4,31±3,06 часов. Осложнения в родах отмечены у 21,9% женщин: в основном – обвитие пуповины в 12,4% случаев. При внешнем осмотре плацента в большинстве случаев не была изменена, в 9,5% - отмечены участки обызвествлений и инфарктов.

Все новорожденные в I группе были недоношенными со сроками гестации от 22 до 36 недели включительно. В эту группу вошли 53,3% девочек и 46,7% мальчиков. Состояние при рождении у 62,9% недоношенных новорожденных было удовлетворительным, у 37,1% - средней степени тяжести. При рождении 50,5% ребенка получили на первой минуте оценку по шкале Апгар 8 баллов, 49,5% новорожденных – 6 баллов. Показатели физического развития недоношенных новорожденных I группы с благоприятным течением неонатального периода не отличались от принятых нормативов весо-ростового коэффициента по (1981) и представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Показатели физического развития недоношенных детей I группы

У большинства недоношенных со сроком гестации 34-36 недели отмечен уровень дисфункции органов 0-1 степени; для недоношенных детей со сроком гестации 28-33 недели были характерны нестойкие дисфункции 1-2 степени. У 10 детей, родившихся при сроке 22-27 недели гестации в силу их морфофункциональной незрелости, дисфункция органов была 2-3 степени. Необходимо отметить, что 4 степени дисфункций органов у данных недоношенных не наблюдалось, что в прогностическом плане сказывалось благоприятно и на фоне проводимой терапии отмечалось улучшение состояния в течение первых 5-14 дней жизни. При выписке на 7-21 день жизни у всех недоношенных новорожденных первой группы состояние оценивалось как удовлетворительное.

До настоящего времени в литературе дискутируется вопрос о степени зрелости иммунной системы недоношенного новорожденного ребенка. Ряд исследователей утверждают, что Т-лимфоциты, выделенные из пуповинной крови, имеют те же фенотипические маркеры дифференциации, что и у взрослых, в то же время другие авторы считают, что Т - и В-клетки новорожденных детей проявляют незрелый фенотип.

Сопоставление показателей иммунного статуса недоношенных новорожденных I группы выявило доминирование признаков депрессии адаптивного иммунитета у недоношенных Ia подгруппы (рисунок 1).

Рисунок 1 – Показатели иммунного статуса недоношенных детей

I группы с учетом гестационного возраста

Содержание CD4+ лимфоцитов (0,87±0,30) было ниже в 1,8 раза, а CD8+ лимфоцитов (0,54±0,11) в 1,5 раза контрольных значений. При этом количество дифференцированных CD3+-лимфоцитов (1,30±0,15) в сравнении с Ic подгруппой было ниже в 1,4 раза, но превышало показатели недоношенных Ib подгруппы в 1,1 раза. Минимальное содержание клеток, несущих маркер апоптоза CD95+ (0,29±0,05), зарегистрировано в подгруппе Ia, что в 2,3 и 1,5 раза ниже (р<0,05) показателей Ib и Ic подгрупп соответственно.

Анализ функциональной активности микрофагоцитарной системы в НСТ-тесте у недоношенных детей со сроком гестации 22-27 недели показал, что спонтанный НСТ-тест был в 1,1 и 1,3 раза выше (р<0,05) по сравнению с показателями недоношенных детей 28-33 и 34-36 недели гестации соответственно; показатель индуцированного НСТ-теста в 1,1 раза выше по отношению к Ic подгруппе, тогда как в сравнении с Ib подгруппой был в 1,2 раза ниже (р<0,05). Разность между базальной и индуцированной активностью нейтрофильных гранулоцитов, характеризующая «резерв» функциональных возможностей, была наименьшей у недоношенных детей Ia подгруппы и составила 29,2%, что в 1,4 раза ниже данных Ic подгруппы (42,4%). Можно предположить, что, несмотря на глубокую недоношенность, у недоношенного ребенка 22-27 недели гестации клетки микрофагоцитарной системы потенциально достаточно зрелы для осуществления свойственных им функций, в частности активации выработки активных форм кислорода. Полученные данные подтверждают существующее мнение (, 2006) о том, что становлению различных звеньев специфического иммунитета предшествует формирование филогенетически древних и примитивных, лишенных специфичности, факторов.

У недоношенных Ib подгруппы становление иммунных процессов сопровождалось возрастанием спектра лимфоцитов с хелперным потенциалом в среднем в 1,4 раза по отношению к Ic подгруппе (1,54±0,08) и 2,4 раза по отношению к Ia подгруппе (0,87±0,30). Количество цитотоксических клеток с фенотипом CD8+ также превышало соответствующие показатели контрольной группы в 2,0 раза и Ia подгруппы в 3,1 раза. На активацию гуморального звена иммунитета в Ib подгруппе указывало высокое количество клеток, экспрессирующих CD20+ (0,89±0,11), что в 1,9 и 1,6 раза превышали аналогичные показатели Ia и Ic подгрупп. В противовес активации В-лимфоцитов отмечена тенденция к сниженному в 1,5 раза синтезу IgG в Ib подгруппе, чем у детей Ic подгруппы (1,04±0,05), тогда как в сравнении с Ia подгруппой он был выше в 2,6 раза (р<0,05). Полученные высокие значения IgG для Ic подгруппы, подтверждаются данными литературы (, 2004), указывающие на усиление пассивного перехода данного иммуноглобулина от матери к ребенку в данный период времени. Статистически значимых различий в содержании IgМ между подгруппами не выявлено. IgА не обнаружен ни в одной из наблюдаемых групп.

У недоношенных детей 28-33 недели гестации зарегистрированы максимальные показа,0±3,01) стимулированного НСТ-теста, превышающие в 1,4 раза показатели контроля. Достоверно высокие резервные возможности (73,9%; р<0,05) превышавшее в 1,7 раза показатели контроля отмечены при исследовании метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов недоношенных детей Ib подгруппы. Уровень функциональных возможностей клеток микрофагоцитарной системы коррелировал с гестационным возрастом (r=0,74, р<0,05), что отражает тенденцию формирования неспецифической резистентности в онтогенезе.

Многие авторы отмечают, что цитокины являются частью сложнейшей цепи взаимосвязанных сигналов, обеспечивающих сходную работу различных систем (, 2009; Emsley Н., 2008). Оценка содержания провоспалительных IL-1β, IL-2, IFN-γ и противовоспалительного IL-10 цитокинов у недоношенных детей во всех подгруппах позволила выявить разновекторный характер изменений (рисунок 2).

Так, о незрелости функциональной активности субпопуляций Т-лимфоцитов недоношенных детей Ia подгруппы свидетельствовали низкие концентрации IL-2, IL-10 и IFN-γ. Установлена прямая корреляционная зависимость между уровнем провоспалительного цитокина IL-1β и сроком гестации новорожденного ребенка (r=0,71; р<0,05). По мере снижения гестационного возраста снижались значения IL-1β. Так, у недоношенных Ia подгруппы определено снижение в 1,6 и 2,8 раза уровня IL-1β в сравнении с Ib и Ic подгруппами (8,01±3,25 и 13,5±2,70 соответственно), что делало организм глубоконедоношенного ребенка более уязвимым к воздействию антигенов.

Рисунок 2 – Показатели цитокинового статуса недоношенных детей

I группы с учетом гестационного возраста

Выявленное нами снижение концентраций цитокинов у детей с низким сроком гестации являлось, по-видимому, следствием меньшего количества клеток, продуцирующих эти медиаторы, и снижением функционально активных клеток, способных экспрессировать цитокины. Так, установлена корреляционная зависимость между количеством моноцитов и концентрацией IL-1β (r=0,72; р<0,05) у недоношенных детей Ia подгруппы. Учитывая значение хелперных клеток в продукции IL-2 и цитотоксических лимфоцитов в выработке IFN-γ, нами изучена корреляционная зависимость между указанными показателями. Так, у глубоконедоношенных детей обнаружилась значимая обратная корреляция количества CD4+ с низким уровнем IL-2 (r=-0,74; p<0,05), CD8+ и IFN-γ (r=-0,59; p<0,05), CD16+ и IFN-γ (r=-0,68; p<0,05).

Обнаружено, что недоношенные Ib подгруппы имели наиболее высокий уровень содержания цитокинов IL-2, IL-10, IFN-γ (p<0,05) по сравнению с другими подгруппами. Так, концентрации IL-2 и IL-10 повышались по сравнению с контролем (63,9±6,74 и 10,2±2,09) в среднем в 1,3 раза, IFN-γ в 1,4 раза. У недоношенных 28-33 недели гестации значимая корреляционная связь установлена между CD4+ и IL-10 (r=0,76; p<0,05), CD95+ и IL-10 (r=0,71; p<0,05), уровнями IL-2 и IL-10 (r=0,81; р<0,05) и умеренная линейная зависимость между IFN-γ и IL-10 (r=0,49; p<0,05). Наблюдаемое однонаправленное повышение цитокинов антагонистов IL-2 и IL-10 в Ib подгруппе являлось отражением продукции как Th1, так и Th2 доминированного профиля медиаторов с различным механизмом действия: пролиферативной активности IL-2 и IFN-γ и антипролиферативного и антиапоптогенного действия IL-10, по-видимому, с одной стороны необходимого в данный период гестации для снижения риска развития системной воспалительной реакции при высокой выработке медиаторов воспаления, а с другой - для предотвращения потери иммунной системой ребенка незрелых лимфоцитов, еще не готовых к полноценному иммунному ответу.

Повышение сывороточного уровня IL-1β в 1,7 раза (13,5±2,70) у недоношенных со сроком гестации, приближенном к физиологическому по сравнению с недоношенными 28-33 недели гестации согласуется с данными литературы об IL-1β как участнике процесса подготовки к родовой деятельности и стимулирующем его влиянии на отторжение в процессе родов плода как антигенночужеродного для матери (, 2000). О взаимосвязи продукции цитокинов и стимуляции Т-звена иммунитета в онтогенезе свидетельствовала высокая корреляционная связь между количеством CD25+, клеток экспрессирующих рецептор к IL-2 с продукцией IL-2 (r=0,79, р<0,01). Выведенный «средний» уровень содержания CD25+ у детей Ib подгруппы превышали в 2,5 и 1,7 раза таковые значения у детей Ia и Ic подгрупп c достоверностью различия (р<0,05). О функционировании межклеточного взаимодействия свидетельствуют прямые корреляционные связи между уровнями медиаторов клеточного и гуморального иммунитета IgG и IL-10 (r=0,74; р<0,05), IgG и IL-2 (r=0,73; р<0,05), наблюдаемые у недоношенных детей Ib и Ic подгрупп.

Таким образом, сравнительный анализ, проведенный между разными возрастными подгруппами недоношенных детей, выявил лабильность иммунологических параметров при сроке гестации 28-33 недели, что можно расценить как достаточно напряженную адаптационно-компенсаторную реакцию иммунной системы с повышением многих показателей по отношению к контролю, за исключением количества CD3+, нейтрофилов, синтеза IgG и IL-1β что, видимо, являлось отражением процессов адаптации к переходным состояниям кроветворения, дыхания и обменных процессов. Вместе с тем, гестационный возраст 28-33 недели, очевидно, является самым уязвимым периодом, когда может наступить срыв напряженных адаптационных механизмов при мощном влиянии внешних неблагоприятных факторов с вероятностью формирования патологии. Представления о внутрисистемных механизмах компенсации позволило нам в дальнейшем неоднозначно трактовать изменения иммунного гомеостаза и соотносить их со всем комплексом клинико-лабораторных данных.

Полученные данные у недоношенных детей при различных сроках гестации являются отражением онтогенетической последовательности формирования факторов иммунной защиты. Разбалансированность иммунорегуляторных процессов, происходящие в морфофункционально незрелом организме, очевидно, с одной стороны, являются иммунологически оправданным феноменом, позволяющим организму недоношенного ребенка максимально адаптироваться к внеутробной жизни, без развития клинических признаков системного воспаления, с другой – это последовательный многоступенчатый защитный механизм, который осуществляет различные межклеточные взаимодействия, поддерживает иммунологическую толерантность, формирует врожденный и адаптивный иммунный ответ.

Клинико-иммунологическая характеристика недоношенных детей II группы. Разделяя точку зрения о ведущей роли факторов антенатального развития в возникновении перинатальной патологии, проведен анализ неблагоприятных факторов анте - и интранатального периодов жизни недоношенного ребенка. Во II группе первобеременных было 37,3%, повторно (2-11) 62,7% женщин. Из них первородящих было 30,5% женщин, повторно (2,5%. Акушерский анамнез рожениц данной группы был отягощен самопроизвольными абортами в 43,2%, выкидышами 23,6%, неонатальной смертью предыдущих детей в 20,5% случаях. Наиболее значимыми факторами риска развития перинатальной патологии было осложненное течение беременности с угрозой прерывания у 46,8% женщин, с хронической гипоксией плода - у 43,2% на фоне кольпита у 74,1%, анемии у 54,5%, ОРЗ у 33,2% женщин, из них в 23,6% с подъемом температуры. Гестоз первой половины был отмечен у 21,8% женщин, гестоз второй половины беременности у 35% женщин, в том числе у 7,7% - средней тяжести. Во время настоящей беременности дородовое излитие околоплодных вод отмечено у 86,4% рожениц. Длительность безводного промежутка колебалась в широких пределах от 0 до 30 часов и в среднем составила 15,17±0,37 часов. Осложнения в родах отмечены у 36,0% женщин, из них обвитие пуповины - в 13,6%, много - или маловодие в 85,5% случаях. При внешнем осмотре патологические изменения в виде очагов дистрофии, обызвествления были установлены в 63,6% плацент.

Во II группу вошли недоношенные дети (n=220) с различной перинатальной патологией со сроками гестации от 22 до 36 недель включительно. Из них 54,5% девочек и 45,5% мальчиков. Общее состояние при рождении у 28,2% недоношенных новорожденных было удовлетворительным, у 53,2% - средней степени и у 18,6% тяжелое. Оценку по шкале Апгар 5-7 баллов на 1' минуте жизни получили 80% недоношенных новорожденных, 20% детей - 4 и менее баллов. Меры реанимации проводились 20,5% новорожденным. Признаки морфофункциональной незрелости были определены у 37,7% недоношенных. Средняя оценка по шкале Ballard составила 54,7±0,85 с размахом колебаний от 67 до 17 баллов (при средней оценке в контрольной группебалла).

В соответствие с задачами исследования нами проведена оценка клинического состояния недоношенных детей с перинатальной патологией, родившихся от матерей с осложненным течением беременности и родов с учетом гестационного возраста. Физические параметры данных недоношенных новорожденных отличались от принятых нормативов весо-ростового коэффициента в сторону уменьшения (таблица 5).

Таблица 5 - Показатели физического развития недоношенных новорожденных детей II группы с перинатальной патологией (n=220) с учетом гестационного возраста.

Неонатальный период протекал с признаками дизадаптации у 65,0% новорожденных. В первые сутки жизни ухудшение состояния до тяжелой степени тяжести отмечалось у 55,9% недоношенных новорожденных детей. Расстройство дыхания, потребовавшее коррекции ИВЛ, наблюдалось у 81,5% новорожденных, с нарушением гемодинамики 2-3 степени у 75,9% новорожденных. У 56,8% младенцев неврологические нарушения имели характер общего угнетения. Из недоношенных новорожденных II группы 28,2% были приложены к груди сразу после рождения, в последующие дни 57,3%. С учетом тяжести состояния 13,6% новорожденных вообще не были переведены на грудное вскармливание. В течение неонатального периода 55,9% младенца были выписаны домой как клинически здоровые, 31,4% детей переданы под диспансерное наблюдение с рекомендациями для лечения и 12,7% детей были переведены на второй этап лечения.

При анализе частоты клинических синдромов у недоношенных детей IIа подгруппы с выраженной церебральной патологией в 55,2% случаев наблюдался синдром угнетения, в 44,2% гипертензионно-гидроцефальный синдром, в 33,7% вегето-висцеральные нарушения. У новорожденных IIb подгруппы в 94,6% случаев обнаружены признаки синдрома дыхательных расстройств (СДР) II типа. У 74,5% недоношенных новорожденных IIс подгруппы доминировал дистрофический процесс с задержкой внутриутробного развития.

У недоношенных с поражением центральной нервной системы установлено выраженное повышение CD8+ и CD16+ в 1,3 раза (1,07±0,09 и 0,98±0,07 соответственно) на фоне снижения количества CD3+ в 1,4 раза (1,28±0,13) и CD4+ лимфоцитов в 1,4 раза (1,13±0,12) по отношению к контрольным значениям (рисунок 3).

Рисунок 3 - Показатели иммунного статуса недоношенных детей

II группы с перинатальной патологией

Иммунный статус детей с поражением органов дыхания отличался максимально значимым увеличением содержания CD3+, CD95+ при низких показателях CD4+ по сравнению с контролем и IIа подгруппой (р<0,05). На напряжение гуморального звена указывали повышение количества CD20+ (0,93±0,11) и концентраций IgG (2,31±0,07), превышавшие показатели контроля (в 1,7 и 2,2 раза), IIа подгруппы (в 1,1 и 1,2 раза), IIс подгруппы (в 1,5 и 1,8 раза) соответственно.

У детей с задержкой внутриутробного развития дефицит Т-клеточного иммунитета характеризовался достоверным снижением (p<0,05) количества CD3+ в 2,5 раза (0,74±0,12), CD4+ в 2,0 раза (0,75±0,11) и CD8+ лимфоцитов в 1,8 раза (0,45±0,07); повышением (p<0,05) показателей CD95+ в 1,6 раза (0,72±0,02), CD20+ в 1,1 раза (0,61±0,08) по отношению к контрольным показателям.

Максимальное содержание CD25+ - клеток значительно превышавшее аналогичные показатели IIа и IIс подгрупп в 1,8 и 2,9 раза было зарегистрировано во IIb подгруппе (0,79±0,01), однако, по сравнению с контролем (0,87±0,02) оно было снижено в 1,1 раза. Следует отметить, что во всех основных подгруппах имел место одинаковый уровень активации Fas-индуцированного апоптоза (CD95+), в среднем в 1,5 раза превышавшие контроль (0,46±0,08). Очевидно, на фоне гемодинамических нарушений, гипоксии, гипотрофии запускаются механизмы, приводящие к нарушению репликации ДНК, что обусловливает повышенный апоптоз.

Наиболее значительный уровень провоспалительного монокина IL-1β в 1,4 раза превышавший контроль зарегистрирован во IIа подгруппе (18,4±3,07), тогда как самый низкий уровень IL-1β определен для IIb подгруппы (12,8±1,58), что было ниже в 1,1 раза уровня зафиксированного для контроля.

Анализ эндогенной продукции IFN-γ во II группе наблюдения показал неоднозначность изменений его в подгруппах. Концентрация IFN-γ у недоношенных IIа подгруппы не имела достоверных различий (р>0,05) в сравнении с контролем (11,3±2,02). Во IIb подгруппе определялось повышение в 1,3 раза содержания IFN-γ и снижение его в 1,3 раза (ρ<0,05) во IIс подгруппе по отношению к аналогичному показателю контрольной группы.

Рисунок 4 - Показатели цитокинового статуса недоношенных детей

II группы с перинатальной патологией

Повышение концентрации провоспалительного цитокина IL-2 (в 1,1 и 1,2 раза) отмечено в подгруппах с церебральной и респираторной патологией, тогда как в подгруппе недоношенных со ЗВУР наблюдалось снижение в 1,4 раза IL-2 по отношению к показателям контроля (63,8±3,01). Выявленное нами снижение IL-2 и IFN-γ у недоношенных с задержкой внутриутробного развития является следствием уменьшения количества и снижения функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Повышение уровня IL-2 во IIа и IIb подгруппах сопровождалось снижением концентрации противовоспалительного цитокина IL-10 в 2,2 и 1,9 раза соответственно по сравнению с контролем (10,2±2,09). Во IIс подгруппе напротив, на фоне сниженного IL-2 наблюдалось повышение IL-10 в 1,1 раза по сравнению с контролем.

Адекватная реакция микрофагоцитарной системы на воспалительный процесс проявлялась повышением в 1,4 и 1,5 раза показателей спонтанного и стимулированного НСТ-теста во IIа подгруппе (18,7±2,21 и 24,4±3,05); в среднем в 1,2 раза в подгруппе IIb (19,0±2,93 и 27,4±3,11) по сравнению с контролем (16,5±2,01 и 23,5±2,37). Во IIс подгруппе полученные значения НСТ-теста (10,5±2,56 и 15,8±1,12) были в среднем в 1,5 раза ниже контрольных, что указывало на истощение бактерицидного потенциала фагоцитирующих клеток.

В подгруппе IIа была установлена корреляционная зависимость между увеличением концентрации IL-1β и количеством моноцитов (r=0,71; ρ<0,05), показателями НСТ-теста (r=0,67; ρ<0,05), свидетельствовавшее о высокой активности макрофагальных клеток, синтезирующих медиаторы воспаления. Средней силы корреляционная связь установлена между IL-2 и CD4+ (r=0,79; ρ<0,05), IL-2 и IL-10 (r=0,81; ρ<0,05). Для подгруппы IIb определены корреляционные связи между показателями: IL-2 и CD8+ (r=0,71; ρ<0,05), IL-2 и IL-10 (r=0,75; ρ<0,05), IFN-γ и IL-10 (r=0,76; ρ<0,05). В подгруппе IIс выявлена значимая обратная корреляция уровня IL-1β с показателями шкалы Апгар на 1минуте (r=-0,72; p<0,05), массо-ростовым коэффициентом (r=-0,71; p<0,05), количеством моноцитов (r=0,82; p<0,05), что не противоречило данным (2000), об участии данного цитокина в патогенезе задержки внутриутробного развития за счет их катаболической направленности в регуляции обмена веществ.

Таким образом, результаты анализа иммунологических показателей недоношенных детей с перинатальной патологией в периоде новорожденности, позволили установить наиболее значимые информативные показатели для каждого вида перинатальной патологии в виде цитокинового сдвига и лабильности содержания цитотоксических клеток при однотипности изменений со стороны некоторых клеточных параметров: снижение хелперной субпопуляции Т-лимфоцитов, CD25+, экспрессирующих рецептор к IL-2, увеличение количества В-лимфоцитов и клеток, несущих маркер апоптоза.

Для прогнозирования реализации перинатальной патологии был использован дискриминантный анализ, который позволил выделить группы риска среди недоношенных детей по выделенным показателям иммунитета. По иммунологическим и клиническим показателям при помощи универсальной статистической программы Statistica 6,0 для Windows была создана дендрограмма, определяющая группы коррелирующих параметров в выборке данных и разделяющая выборки на однородные подвыборки (рисунок 5).

По представленной дендрограмме выявлены факторные модели, описывающие влияние на прогнозируемую величину не одного, а ряда факторов, зависимость которых может быть выражена уравнением, которое является наиболее эффективной прогнозной моделью.

Рисунок 5 – Дендрограмма (иерархическое дерево) иммунологических показателей недоношенных детей с перинатальной патологией

Построение модели осуществлялось путем подстановки значений факторов и показателей иммуннограммы в уравнение, с последующим вычислением прогнозируемого значения. Признаки, включенные в дискриминантный анализ и коэффициенты линейной классификационной функции по иммунологическим параметрам приведены в таблице 6.

Таблица 6 – Прогностические канонические коэффициенты дискриминантной функции классификации недоношенных детей по группам наблюдения

Линейная классификационная функция (модель) в данном случае имела следующий вид: Y = 0,264*х1 + 0,014*х2 - 0,004*х3 - 0,097*х4 - 0,017*х5 + 0,013*х6 + 0,011*х7 + 0,001*х8 + 0,002*х9 - 0,034*х10 - 0,008*х11 + 0,017*х12 + 0,001*х13 + 0,021*х14 + 0,547*х15 + 0,005*х16 + 0,269*х17 + 0,002*х18 + 0,009*х19 - 0,003*х20 - 0,019*х21 - 7,434. При внесении показателей иммунитета недоношенного ребенка в представленное уравнение (модель) и вычислении конечного результата, его можно отнести к одному из трех видов перинатальной патологии.

Таким образом, подставляя определенные значения исследуемых иммунологических показателей в уравнение (модель) можно вычислить прогнозируемые значения канонических переменных для отнесения недоношенных детей к той или иной группе по развитию перинатальной патологии и определить близость к средним значения канонических дискриминантных переменных для каждой кластерной группы недоношенных детей. Так, для группы детей с благоприятным течением неонатального периода определено среднее значение канонической переменной ≥0,677; с церебральной патологией ≤-0,374; с респираторными нарушениями ≤-0,714; с задержкой внутриутробного развития ≥0,969.

Характеристика состояния иммунного статуса у недоношенных детей с перинатальной патологией с учетом гестационного возраста. Был проведен сравнительный анализ иммунологических показателей при перинатальной патологии в зависимости от гестационного возраста. В группе недоношенных с церебральной патологией распределение по гестационному возрасту представлено следующим образом: 22-27 недели - 13,5%, 28-33 недели - 40,7% и 34-36 недели - 45,8% недоношенных.

Выраженные иммунологические изменения в виде дефицита моноцитов, снижения содержания CD3+ (в 1,5 раза от контроля), субпопуляций CD4+, CD8+ и CD20+ (в 2,3, 1,9 и 1,8 раза по отношению к контролю соответственно) на фоне низких концентраций всех изучаемых цитокинов, IgМ и IgG, определялись у глубоконедоношенных детей. Сочетание значительного снижения в 2,8 раза клеток ранней активации - CD25+ с повышенным содержанием в 1,2 раза и в 1,1 раза CD95+ и CD16+, возможно, обусловлено нейродеструктивными нарушениями на фоне морфофункциональной незрелости центральной нервной системы и может расцениваться как диагностический критерий формирования гипоксически-ишемической энцефалопатии. Снижение в 1,1 раза по отношению к контролю стимулированной функциональной активности микрофагоцитарной системы при сохранившейся на уровне нормы спонтанной активности свидетельствовала о низком резервном потенциале клеток неспецифического иммунитета. Резерв функциональной активности фагоцитирующих клеток составил 26,2%, что ниже в 1,6 раза контрольных показателей (рисунки 6 и 7).

В группе недоношенных при сроке гестации 28-33 недели с перинатальной энцефалопатией выявлено перераспределение в сторону увеличения по отношению к контролю и снижения в сравнении с Ib подгруппой следующих показателей: CD8+ (в 2 раза в сравнении с контролем и в 1,5 раза по отношению к Ib подгруппе), концентраций IFN-γ (в 1,2 и в 1,1 раза соответственно), IL-2 (в 1,1 и 1,2 раза соответственно), CD4+ (увеличение и снижение в 1,2 раза соответственно), CD20+ (увеличение и снижение в 1,3 раза соответственно).

Рисунок 6 – Показатели иммунного статуса недоношенных детей

IIа подгруппы с церебральной патологией с учетом срока гестации (абс. чис.)

Значения CD3+, напротив, по отношению к контрольным показателям были умеренно снижены в 1,0 раза, а в сравнении с Ib подгруппой повышены в 1,5 раза. Снижения в 1,3 и 1,6 раза по отношению к контролю и значительные уменьшения в 2,2 и 2,0 раза в сравнении с «условно» здоровыми недоношенными детьми Ib подгруппы регистрировалось по показателям CD25+ и IL-10 соответственно. Положительный сдвиг некоторых параметров в сторону контрольных значений, очевидно, связано со снижением исходно высоких показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета, выявленных у «условно» здоровых недоношенных того же возрастного периода. Снижение способности фагоцитарных клеток к полноценному ответу в стимулированном НСТ-тесте на фоне повышенной спонтанной активности, подтверждалось данными литературы о низкой функциональной активности микрофагоцитарной системы новорожденных, перенесших внутриутробную гипоксию. Исследование разности между спонтанной и стимулированной показателями НСТ-теста продемонстрировало снижение в 3 раза по отношению к контролю резервной возможности фагоцитарных клеток.

Рисунок 7 – Показатели цитокинового статуса недоношенных детей

IIа подгруппы с церебральной патологией с учетом срока гестации

У недоношенных 34-36 недели гестации выявлялось снижение количества CD4+ в 1,3 раза по сравнению с контролем, уменьшение концентраций IL-10 (в 1,3 раза) и IgG (в 1,5 раза) на фоне сохраняющегося на уровне контроля синтеза IgМ в сочетании с повышенным содержанием CD3+ и CD20+ - лимфоцитов (в 1,1 раза), CD8+ (в 1,0 раза) и уровня цитокинов IL-1β и IL-2 (в 1,3 раза), и IFN-γ (в 1,1 раза). Наряду с этим прослеживалось повышение спонтанной активности (в 1,2 раза) со сниженной мобилизацией резервных возможностей (в 1,1 раза) микрофагоцитарной системы в НСТ-тесте, что также подтверждалось и показателями определения разности между базальной и индуцированной возможностью фагоцитов сниженной в 2 раза по отношению к контролю.

В группе недоношенных с респираторной патологией распределение по гестационному возрасту представлено следующим образом: 22-27 недели - 12%, 28-33 недели – 43% и 34-36 недели - 45% недоношенных новорожденных.

У глубоконедоношенных детей обнаружены низкие показатели основных субпопуляций Т-лимфоцитов (в 2-2,5 раза) и CD3+, а также всех цитокинов и в сравнении с другими возрастными подгруппами и контролем. Незначительное повышение в 1,1 раза уровня IL-1β, в 1,2 раза CD95+ клеток, в 1,2 раза CD20+, в 1,0 раза уровня IgM зарегистрировано по отношению к показателям «условно» здоровых недоношенных Ia подгруппы (рисунки 8 и 9). При сравнительном анализе активности микрофагоцитарной системы для недоношенных детей со сроком гестации 22-27 недели было характерно снижение спонтанного и стимулированного показателей НСТ-теста как по отношению к контролю, так и к показателям Ia подгруппы. Разность между стимулированной и базальной активностью, характеризующая резерв функциональной активности, в группе недоношенных детей с респираторной патологией была наименьшей у недоношенных 22-27 недели гестации (21,5%) при показателях контроля (42,4%).

Наличие дыхательных нарушений у недоношенных 28-33 недели гестации приводило к формированию иммунной недостаточности, что выражалось в значительном уменьшении в 3,3 раза количества CD25+, снижении в 1,8 раза CD4+, в 1,4 раза CD8+, уровня выработки IL-1β (в 1,3 раза) и IL-10 (1,2 раза) по сравнению с контролем.

Рисунок 8 – Показатели иммунного статуса недоношенных детей

IIb подгруппы с респираторной патологией с учетом срока гестации (абс. чис.)

В данной подгруппе недоношенных зафиксировано повышение в 1,3 раза количества CD3+ в сравнении с показателями Ib подгруппы, но по отношению к контролю отмечено его снижение в 1,1 раза. Было определено увеличение уровня продукции IL-2 (в 1,4 раза), IFN-γ (в 1,6 раза) и IgG (в 1,2 раза) на фоне повышенного в 1,6 раза количества В-лимфоцитов. Функциональная активность фагоцитарных клеток в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте у недоношенных 28-33 недели гестации была повышена (в 1,2 и 1,1 раза соответственно) по отношению к контролю, в то время как в сравнении с недоношенными Ib подгруппы регистрировалось снижение в 1,2 раза восстановительного потенциала фагоцитов при стимуляции пирогеналом. Снижение разности между стимулированной и базальной активностью фагоцитов (27,1%) в 1,6 раза в сравнении с контролем отмечено у недоношенных детей данной подгруппы.

У недоношенных с гестационным возрастом 34-36 недели с респираторной патологией характерными и отличительными признаками от контроля были следующие изменения: значимое повышение CD3+, превышающие контрольные значения в 1,3 раза, CD4+ и CD20+ в 1,2 раза, CD16+ в 1,2 раза, сопровождающееся увеличением уровня IL-2 в 1,4 раза, IFN-γ в 1,2 раза, IL-1β в 1,3 раза и концентраций IgG в 1,3 раза.

Рисунок 9 - Показатели цитокинового статуса недоношенных детей IIb подгруппы с респираторной патологией с учетом срока гестации

Кроме того, имело место увеличение уровня CD95+ в 1,5 раза и снижение уровня IL-10 в 1,4 раза по сравнению с контрольными данными, что являлось признаком активности процессов апоптоза и прогностически неблагоприятным показателем. Формирование респираторной патологии не оказывало влияния на показатели CD8+ и CD25+, сходных с уровнем контрольных значений. У недоношенных 34-36 недели гестации наблюдалось повышение бактерицидной активности нейтрофильных гранулоцитов в спонтанном НСТ-тесте в 1,2 раза и стимулированном в 1,3 раза по отношению к контролю. Высокие резервные возможности фагоцитарных клеток, превышающие данные контроля в 1,7 раза отмечены у недоношенных с респираторной патологией в данной возрастной подгруппе.

В группе недоношенных со ЗВУР распределение по гестационному возрасту представлено следующим образом: 22-27 недели - 7% детей, 28-33 недели – 29% и 34-36 недели – 64% недоношенных новорожденных.

По данным некоторых авторов (, 2008; , 2004; Schauf B. et al., 2003), у недоношенных новорожденных со ЗВУР отмечалась повышенная супрессорная активность иммунной системы. Сравнительный анализ, проведенный между недоношенными с задержкой внутриутробного развития различного гестационного возраста выявил для недоношенных детей со сроком гестации 22-27 недели снижение количества CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+ (в 1,4 и более раз), уровня цитокинов IFN-γ, IL-1β, IL-2 и IL-10 (ρ<0,05) по отношению к контрольным значениям и показателям Ia подгруппы (рисунок 10 и 11).

Рисунок 10 - Показатели иммунного статуса недоношенных детей IIс подгруппы со ЗВУР с учетом срока гестации (абс. чис.)

Ингибиция продукции цитокинов, имевшая место у глубоконедоношенных детей, являлось показателем несовершенства развития клеток, морфофункциональной незрелости организма, особенно у недоношенных детей со ЗВУР.

Наиболее выраженные сдвиги у недоношенных 28-33 недели гестации со ЗВУР установлены по следующим величинам: снижение в 4,2 раза в сравнении с Ib подгруппой и в 3 раза - с контролем для CD4+; уменьшение в 2,7 раза к данным Ib подгруппы, в 1,4 раза по отношению к контролю для CD8+. В сравнении со значениями Ib подгруппы наблюдалось повышение в 1,1 раза содержания CD3+, тогда как в сравнении с контролем оно было снижено в 1,1 раза. Количество CD20+ и CD25+ по сравнению с контрольной группой были повышены в 1,2 раза, хотя по отношению к данным «условно» здоровых недоношенных идентичного возраста были снижены в 1,3 и 1,4 раза. Различия по CD95+ в виде повышения в 1,3 раза определены только по отношению к контролю. Концентрации IL-1β и IL-10 превышали показатели контроля и Ib подгруппы в среднем в 1,2-1,3 раза на фоне снижения уровней IFN-γ и IL-2.

У недоношенных 34-36 недели гестации наличие ЗВУР ассоциировано с повышенным содержанием в 1,8 раза В-лимфоцитов, в 1,5 раза CD95+, со сниженным в 2 раза количеством CD25+ и в 1,6 раза CD4+ при отсутствии достоверных различий в содержании CD16+ по отношению к контролю.

Рисунок 11 – Показатели цитокинового статуса недоношенных детей

IIc подгруппы со ЗВУР с учетом срока гестации

Результаты НСТ-теста, как стимулированной, так и уровня базальной продукции активных форм кислорода, имели различия в зависимости от гестационного возраста ребенка. Оценка неспецифической резистентности выявила снижение показателей спонтанного и индуцированного НСТ-теста у глубоконедоношенных детей, тогда как в других возрастных группах регистрировалось повышение метаболической активности в спонтанном (20,1±3,09 и 17,8±2,71) и индуцированном (25,2±3,13 и 28,3±3,18) НСТ-тестах по отношению к контролю. О резервных возможностях функциональной активности фагоцитов судили по разности между данными стимулированной и базальной НСТ-теста, что выявило наименьшие показа,3%) у недоношенных 28-33 недели гестации при показателях контроля (42,4%) и наибольшее значение (58,9%) в подгруппе недоношенных 34-36 недели гестации.

Таким образом, проведенные исследования показали, что в зависимости от гестационного возраста перинатальная патология у недоношенных детей проявлялась формированием трех вариантов нарушений иммунного статуса: компенсированным, субкомпенсированным и декомпенсированным. Для недоношенных детей 22-27 недели гестации было характерно развитие иммунологически «декомпенсированного» состояния, что проявлялось угнетением клеточного иммунитета сопровождавшегося незначительной активацией процессов апоптоза и гуморального иммунитета. Другой вариант иммунных нарушений в виде повышения параметров, ответственных за гуморальную защиту и неспецифическую резистентность, увеличения количества дифференцированных и хелперных Т-лимфоцитов с усилением продукции провоспалительных медиаторов, снижения количества цитотоксических клеток и уровня IL-10 зарегистрирован у недоношенных 28-33 недели гестации и характеризуется как «нарушенное компенсированное». Третий вариант - «субкомпенсированные» нарушения в виде активации хелперной субпопуляции Т-лимфоцитов при сохраняющейся на уровне нормы содержании цитотоксических клеток и увеличения количества дифференцированных лимфоцитов, бактерицидной активности микрофагоцитарной системы определялся у недоношенных детей 34-36 недели гестации.

Иммунологическая реактивность недоношенных детей при хроническом течении внутриутробной цитомегаловирусной инфекции. Анализ полученных данных при исследовании иммунного статуса у недоношенных новорожденных с верифицированной внутриутробной цитомегаловирусной инфекцией позволил выделить две группы с разновекторным направлением иммунологических показателей: недоношенные со сниженными показателями иммунного статуса составили IIIa подгруппу; недоношенные с повышенными показателями иммунного статуса вошли в IIIb подгруппу.

Исследование спектра лимфоцитов по CD-маркерам в двух подгруппах показало: снижение CD3+(в 1,2 раза), CD4+ (в 2,6 раза), CD8+ (в 2 раза) по отношению к контролю у недоношенных IIIа подгруппы и значительное повышение количества CD3+ (в 1,3 раза), CD4+ (в 1,3 раза), CD8+ (в 2,8 раза) у недоношенных IIIb подгруппы с определением повышенного присутствия CD20+ в обеих подгруппах, но более высокое содержание, превышавшее в 1,6 раза показатели контроля определено у недоношенных IIIb подгруппы. Концентрация IgG была в 2 раза ниже у недоношенных IIIа подгруппы и соответствовала критически низкому уровню (менее 0,5 г/л), тогда как в IIIb подгруппе было выявлено увеличение в 1,2 раза уровня IgG по отношению к контролю. Очевидно, высокая концентрация IgG, связана с возможным транспортом иммуноглобулинов от матери через поврежденную гипоксией и инфекцией плаценту, а с другой стороны, это может служить показателем присоединения аутоиммунного компонента, так как уровень иммуноглобулинов прямо коррелировал с уровнем содержания цитотоксических CD8+ и CD16+ лимфоцитов (r=0,81, p<0,01) у недоношенных IIIb подгруппы. Колебание активационных и апоптических параметров с тенденцией к повышению в 1,7 раза количества CD95+ по сравнению с контролем (0,26±0,05) и снижения в 1,8 раза количества CD25+ отмечено у недоношенных IIIа подгруппы. В литературе существуют разноречивые данные о влиянии внутриутробного инфицирования на процессы дифференцировки Т-лимфоцитов, поэтому мы сочли необходимым провести анализ продукции Th1- и Th2-профильных цитокинов по определению функциональной активности хелперов. Для гипореактивного течения было характерно снижение эндогенной продукции IL-1β, IL-2 и IFN-γ (в 2,2, 1,3 и 1,2 раза соответственно), что возможно связано с влиянием таких супрессивных факторов как длительная внутриутробная персистенция цитомегаловирусов, так и негативного влияния других представителей цитокиновой сети. Это обстоятельство подтверждалось (р<0,05) высокой продукцией противовоспалительного IL-10 на фоне уменьшения количества иммунокомпетентных клеток-эффекторов наблюдаемой у недоношенных IIIа подгруппы, что видимо и является механизмом, ингибирующим активацию Th1 и фагоцитарных реакций иммунной системы, на фоне антигенной стимуляции. Подъем в 1,7 и 1,4 раза уровней IL-2 и IFN-γ - наиболее чувствительных маркеров внутриутробного инфицирования у недоношенных IIIb подгруппы - свидетельствовали об активации Th1. Исследование наличия корреляционной связи между уровнем IL-2 у недоношенных IIIb подгруппы с: оценкой по Апгар на 1 минуте жизни выявило прямую корреляционную зависимость (r=0,62; р<0,05); количеством CD4+ (r=0,76; р<0,05); содержанием CD8+ (r=0,65; р<0,05). Концентрация IFN-γ прямо коррелировала с количеством CD16+ лимфоцитов (r=0,72; р<0,05), CD8+ и с фагоцитарной активностью нейтрофилов (r=0,79 и 0,81, соответственно; р<0,05).

Высокие концентрации IL-1β, превышавшие контроль в 2,6 раза, сигнализировали о максимальной интенсивности воспалительных реакций и подтверждали Th1 направленность действия иммунной системы, потому что эти лимфоциты - основные модуляторы макрофагального звена иммунитета. Прямая корреляционная связь, установленная между концентрацией IL-1β и IgG (r=0,81, p<0,01), возможно, свидетельствовала о способности IL-1β увеличивать прони­цаемость гематоэнцефалического барьера, что делает доступным взаимодействие факторов иммунной системы с антигенами мозга, и как следствие этого развитие наблюдаемой нами гиперпродукции IgG. Несмотря на повышение спонтанной функционально-метаболической активности микрофагоцитов в НСТ-тесте в двух подгруппах, индуцированная была в 2 раза ниже у недоношенных IIIа подгруппы по сравнению с IIIb подгруппой, что свидетельствовало об истощении резервной способности нейтрофильных гранулоцитов продуцировать активные формы кислорода. Дисбаланс окислительного метаболизма при воспалении индуцирует запуск программы апоптоза иммуноцитов, что подтверждалось изменениями соотношения субпопуляций CD4+ и CD95+, в сторону процессов индуцирования апоптоза и ослабления иммунного ответа, на это указывало и снижение в 2,2 раза уровня IL-1β. Гипореактивный ответ у большинства детей позволяет предположить, что имеет место проявление иммунологической толерантности под воздействием антигенной нагрузки, хотя нельзя исключить и возможность непосредственного воздействия инфекционного агента на функциональную активность Thl-лимфоцитов и NK-клеток, по механизму обратной связи приведший к появлению специфических супрессорных клеток, которые препятствуют развитию иммунной реакции на соответствующий антиген. Тем не менее, установленный факт «инертности» иммунной системы при развитии воспалительного процесса имеет место быть и требует более глубокого анализа. Вместе с тем, несмотря на дефицит иммунокомпетентных клеток приводящий к уменьшению «каскада» основных регуляторных цитокинов, даже такой ответ позволяет недоношенным детям IIIа подгруппы осуществлять различные межклеточные взаимодействия.

В наших наблюдениях при проведении корреляционного анализа было установлено, что уровень IL-1β у недоношенных детей IIIа подгруппы имел прямую корреляционную связь с количеством нейтрофилов пуповинной крови (r=0,68, р<0,05), величиной спонтанного НСТ-теста (r=0,77, р<0,05), уровнем индуцированной активности нейтрофильных гранулоцитов (r=0,82; р<0,05). Сам факт низких показателей IL-1β указывал на снижение функциональных свойств нейтрофилов в крови, а соответственно пролонгирование недостаточности лимфоцитарного звена иммунитета и расценивался как проявление иммунной недостаточности у недоношенных детей IIIa подгруппы. INF-γ прямо коррелировал с абсолютным числом CD3+ лимфоцитов (r=0,79; р<0,05), CD8+ лимфоцитов (r=0,74; р<0,05), количеством CD16+ лимфоцитов (r=0,81; р<0,05), с уровнем IgG (r=0,69; р<0,05).

Таким образом, выделение двух лабораторных вариантов иммунных реакций дает возможность оценить целесообразность использования полученных данных в системе мониторинга патологического состояния недоношенных, что позволяет совершенствовать тактику ведения недоношенных новорожденных на ранних стадиях инфекционного процесса в каждом конкретном случае, избегая трудоемких, дорогостоящих обследований, сводя к минимуму в случаях с низким риском прогрессирования заболевания и более тщательный контроль в случаях высокой вероятности развития инфекции у недоношенных.

Генетический анализ полиморфизма генов IL-1Ra (rs4251961), IL-2Ra (rs) и IL-10 (rs1800896) у недоношенных детей с хроническим течением ЦМВИ. Наряду с изучением иммунологического ответа у недоношенных с внутриутробной цитомегаловирусной инфекцией проводился молекулярно-генетический анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов IL-1Ra, IL-2Ra и IL-10 с оценкой влияния на экспрессию и продукцию соответствующих белков при выявленных вариантах иммунологической реактивности.

В наблюдаемых подгруппах недоношенных детей при генетическом анализе выявлена точечная нуклеотидная замена G->A в позиции 1082 в промоторной области rs1800896 гена IL-10, что ассоциировано с уменьшением транскрипции гена и продукции белка. Сравнительный анализ распределения генотипов в основных подгруппах выявил следующее: в IIIa подгруппе преобладание гомозиготного генотипа GG и аллеля G, доля которых достигла 54% и 74% соответственно, тогда как для IIIb подгруппы было характерно преобладание гетерозиготного варианта G/А (51%) и гомозиготного А/А (9%) (таблица 7).

Таблица 7 – Частота встречаемости генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1800896 гена IL-10 недоношенных детей с ЦМВИ

В подгруппе IIIb установлено снижение (в 1,5 и 1,8 раза соответственно) встречаемости генотипа G/G и значительное повышение (в 9 и 3 раза соответственно) встречаемости генотипа А/А по сравнению с контролем и IIIa подгруппой.

При анализе частот аллельных вариантов в подгруппе IIIb обнаружено повышение в 1,5 раза встречаемости аллеля А по отношению к контролю и подгруппе IIIa. Согласно полученным результатам наличие гомозиготного варианта А/А rs1800896 является определяющим более низкий уровень продукции противовоспалительного цитокина IL-10, что проявлялось меньшей супрессией воспалительного ответа.

Таким образом, генотип А/А полиморфного маркера rs1800896 гена IL-10 является факторами риска развития дефицита продукции IL-10 (OR=2,195 chi2=11,77, p<0,01), что, безусловно, оказывает влияние на степень активации иммунного ответа при хроническом течении внутриутробной цитомегаловирусной инфекции.

При исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs4251961 гена рецептора IL-2 альфа (CD25, IL-2Ra) у недоношенных IIIb подгруппы наличие гомозиготного варианта мутантного аллеля А определялось в 1,5 и 1,7 раза чаще, чем в контроле и у детей IIIa подгруппы. Тогда как аллель G в гомозиготном виде у обследованных детей IIIb подгруппы присутствовал в 1,1 раза реже, чем в контроле и IIIa подгруппе (таблица 8).

Таблица 8 - Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs гена IL-2Rа у недоношенных детей с ЦМВИ

Носителями варианта G как в гомо-, так и в гетерозиготном виде являются в среднем 77% недоношенных детей всех обследуемых групп. При анализе встречаемости гетерозиготного варианта G/A установлено, что сочетание гомозиготных вариантов гена в IIIb подгруппе встречалось у 19% недоношенных детей, что в 1,4 раза реже, чем в группе контроля и в 1,2 раза, чем в IIIa подгруппе. Генотип А/А встречался только в IIIb подгруппе у 8% детей. Среди недоношенных IIIa подгруппы и контроля не было выявлено носительства гомозиготного варианта генотипа А/А гена IL-2Ra, хотя утверждать, что этот генотип вообще не встречался у данной категории не правомочно т. к. выборка (75 детей с ЦМВИ и 57 «условно» здоровых недоношенных детей) недостаточна, для суждения о встречаемости в популяции в целом. Необходимы дальнейшие исследования с расширением групп детей с различной патологией воспалительного и невоспалительного генеза. Тем не менее, иммунореактивное течение хронической внутриутробной цитомегаловирусной инфекции ассоциируется с аллелем А и гомозиготным вариантом генотипа А/А гена IL-2Rа (OR=1,49 и 3,90, p<0,01 соответственно). Проведенный корреляционный анализ уровня продукции IL-2 у недоношенных детей IIIb подгруппы с учётом распределения вариантов гена IL-2Ra выявил наличие прямой корреляционной связи продукции цитокина от мутантного аллеля гена (p<0,05).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об ассоциации генотипа А/А и аллеля А с повышенной рецепцией IL-2Ra и, соответственно, с более выраженной воспалительной реакцией при хроническом течении внутриутробной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных детей.

Таблица 9 – Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs4251961 гена IL-1Ra у недоношенных с ЦМВИ

Проведение типирования полиморфного локуса rs4251961 гена IL-1Ra в подгруппах IIIa и IIIb не выявило статистически достоверных различий. У недоношенных детей двух подгрупп частота встречаемости мутантного аллеля С была ниже в среднем в 1,1 раза, чем в группе контроля (таблица 9). Гомозиготных мутаций С/С не зарегистрировано ни в одной группе, возможно, это связано с недостаточным размером выборки. Гетерозиготный вариант генотипа Т/С в обеих подгруппах выявлялся в среднем в 1,2 раза чаще, чем в группе контроля. Нами не выявлено разницы в частоте встречаемости полиморфизма аллельных вариантов rs4251961 гена IL-1Ra в исследуемых группах недоношенных детей с ЦМВИ (OR=0,85, chi2=1,65).

Таким образом, проведённое исследование по влиянию полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов IL-1Ra, IL-2Ra и IL-10 на экспрессию и продукцию соответствующих белков при выявленных вариантах разнонаправленности изменений иммунного статуса свидетельствовало о том, что:

1) гомозиготный вариант генотипа А/А полиморфного локуса rs1800896 гена IL-10 ассоциирован с низким уровнем продукции IL-10;

2) для гомозигот по аллелям А rs гена IL2Ra выявлен риск развития гиперрецепции IL-2Ra, чем для гомо - и гетерозигот по аллелям G;

3) не выявлено ассоциации полиморфного локуса rs4251961 гена IL-1Ra с повышением риска развития гиперреактивного иммунного ответа при хроническом течении внутриутробной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных детей.

Клинико-иммунологическая характеристика состояния недоношенных детей с перинатальной патологией в течение первого года жизни. При анализе особенностей развития и состояния здоровья детей в ходе катамнестического наблюдения была избрана «условная» возрастная норма – возраст 12 месяцев, для характеристики ближайшего катамнеза недоношенных детей. Это обусловлено тем, что по данным литературы к этому возрасту происходит наиболее интенсивное становление функциональных систем.

Катамнестическое наблюдение проведено за 43 недоношенными детьми в возрасте первого года жизни в амбулаторных условиях. Недоношенные дети, рожденные на разных сроках гестации были выписаны из родильных домов, перинатального центра и отделения патологии новорожденных на сроках от 5-21 дня жизни. Мальчиков было 20, девочек - 23. Почти в 85% случаев дети родились от матерей с отягощенным преморбидным фоном: акушерско-гинекологической и соматической патологией. Из осложнений течения беременности чаще всего имелись преэклампсия, дородовое излитие околоплодных вод, УПБ и хроническая фетоплацентарная недостаточность.

Анализ данных анамнеза, объективного осмотра, клинико-функциональных оценок физического и нервно-психического развития в динамике, дает основание предполагать, что период адаптации в течение первого года жизни оказался сложным для недоношенных детей.

В течение первого жизни восстановительный период характеризовался развитием таких синдромов, как астено-вегетативный (90%), гипертензионно-гидроцефальный (25,4%), задержка психомоторного развития (22,7%), пирамидной недостаточности (18,1%), судорожный (13,6%). Запаздывание навыков и умений в зависимости от возраста отмечены в 37,1% случаев. ДЦП (9,4%) и гидроцефалия диагностированы у (9,4%) детей соответственно. Функциональные методы исследования с помощью УЗИ центральной нервной системы и КТМ у 13 детей выявили значительные изменения ЦНС. По результатам клинико-функциональных исследований 5 (22,7%) детей переведены на инвалидность с диагнозами ДЦП, гидроцефалия, травма головного мозга. Фоновая патология развивалась часто и в более ранние сроки. Так, частота железодефицитной анемии составила 40%, белково-энергетической недостаточности питания – 27,2%, рахита – 18,1%, с достаточно высоким инфекционным индексом – 41,6%, заболели респираторной патологией (ОРВИ, бронхит, пневмония) 31,1% детей, из них 12 детей с пневмонией были госпитализированы.

Таким образом, катамнестическое наблюдение за 43 недоношенными детьми с церебральной и респираторной патологией и задержкой внутриутробного развития, позволило выявить соматическую патологию, преимущественно фоновую и достаточно высокий инфекционный индекс.

Установлено, что на фоне морфофункциональной незрелости недоношенных детей, характер течения перинатальной патологии в большей мере зависит от иммунологической реактивности ребенка. При наличии доказанных критериев состояния здоровья, в том числе иммунологических, позволяющих мониторировать и прогнозировать динамику течения заболевания можно с большей уверенностью проводить дифференцированно комплексную терапию, направленную на коррекцию иммунологических нарушений.

У детей с перинатальной патологией в возрасте 6 и 12 месяцев жизни проведен мониторинг иммунного статуса (рисунок 12).

Рисунок 12 - Показатели иммунного статуса недоношенных детей в течение первого года жизни (абс. ч.)

В контрольную группу вошли 24 «условно» здоровые недоношенные дети в возрасте 1 года. Так, в возрасте 1-го года жизни прослеживалась положительная динамика в виде подъема в 1,3 и 2 раза абсолютных значений дифференцированных CD3+ и хелперных Т-лимфоцитов относительно показателей, полученных в возрасте 6 месяцев жизни (1,46±0,02 и 0,43±0,02), но так и не достигшие нормативных показателей (2,83±0,02 и 1,03±0,12 соответственно). У детей в 12 месяцев жизни содержание CD8+ лимфоцитов оставалось повышенным в 1,6 раза от контроля (0,35±0,02), хотя в сравнении с данными детей 6 месяцев жизни наблюдалось его снижение в 1,3 раза. Эта динамика отразилась и на соотношении основных регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов CD4/CD8 в виде снижения до 1,47±0,04 по сравнению с контролем (2,94±0,13). У детей в возрасте 12 месяцев жизни количество CD16+ существенно в 2,6 раза снижалось по отношению к показателям в 6 месяцев жизни (1,85±0,21), однако оставалось выше контроля (0,23±0,14) в среднем в 3,1 раза.

Практически у всех детей к году жизни отмечена более выраженная тенденция к активации иммунокомпетентных клеток, о чем можно судить по увеличению в 2 раза клеток, экспрессирующих маркер активации CD25+ по сравнению с показателями 6 месячных младенцев (0,43±0,06). В то же время доля CD25+ в год жизни у недоношенных с перинатальной патологией на 14,7% ниже аналогичного показателя здоровых детей этой же возрастной категории (1,02±0,04). Количество CD95+ у обследуемых детей в 1 год жизни (0,49±0,03) почти в 3 раза превышало соответствующие показатели «условно» здоровых детей (0,16±0,08). В течение всего периода наблюдения отмечена тенденция к улучшению и стабилизации показателей гуморальной защиты. Прирост в 1,2 раза количества клеток с фенотипом CD20+ наблюдалось в интервале между 6 и 12 месяцами жизни с последующей стабилизацией (0,92±0,10) на уровне нормативных значений к 12 месяцам жизни.

При исследовании секретирующей способности В-клеток по синтезу гуморальных факторов в сроки до года жизни повышение содержания IgМ у детей с перинатальной патологией не обнаружено. У годовалых детей обследуемой группы уровень IgМ (0,46±0,01) в сыворотке крови оставался сниженным в среднем в 1,8 раза по сравнению с контролем (0,81±0,06). Несмотря на повышение в 2,5 раза концентрации IgG у детей к 12 месяцам жизни по отношению к его уровню в 6 месяцев жизни (0,99±0,12), восстановления иммуноглобулинов до уровня контроля (4,24±1,42) не произошло (р<0,001). Примечательно, что у детей в 6 месяцев жизни концентрация иммуноглобулинов по сравнению с показателями при рождении были достоверно ниже (р<0,05), что, по-видимому, связано с ослаблением пассивного гуморального иммунитета в связи с катаболизмом материнских антител.

Состояние микрофагоцитарной системы у обследованных детей в возрасте 6 и 12 месяцев жизни характеризовалось истощением функциональных резервов кислородзависимых микробицидных систем (15,7±2,69 и 13,1±2,14 соответственно при контроле 23,9±3,77) в ответ на антигенную нагрузку в НСТ-тесте. Причем, разница между базальным и индуцированным уровнем активации (44,8% в контроле) составила 25,6% в 6 месяцев жизни и снизилась до 21,3% к 12 месяцам жизни, что свидетельствует о депрессии функциональной активности фагоцитарных клеток.

Рисунок 13 - Показатели цитокинового статуса недоношенных детей

в течение первого года жизни

Анализ спектра цитокинов в катамнезе наблюдения выявил значительное снижение продукции IL-2 (в 2,6 раза и 1,9 раза) к 12 месяцам жизни по отношению к показателям в 6 месяцев жизни (111,8±9,88) и «условно» здоровых детей (80,5±2,35). Отсутствие нормализации провоспалительного IL-2 может свидетельствовать как о сохранности воспалительно-реактивных изменений цитокинового статуса в 6 месяцев жизни, так и о тяжести перенесенного заболевания и глубине поражения патологических процессов к году жизни. С такой динамикой уровня IL-2 коррелировала частота перинатальной энцефалопатии, проявлявшаяся неврологическими отклонениями от нормы в возрасте 6 месяцев жизни у 87% детей и у 44,7% детей в возрасте 12 месяцев жизни.

В течение всего периода наблюдения отмечено постепенное снижение концентрации IL-1β, но все же, к 12 месяцам жизни уровень IL-1β превышал в 1,7 раза показатели контроля (2,37±0,04). Сохраняющиеся высокие значения IL-1β, видимо, косвенно отражали не завершенность процессов нейродеструктивных, катаболических нарушений. При анализе взаимосвязи IL-1β с другими показателями выявлена обратная корреляция с уровнем IL-2 в сыворотке крови (r=-0,72, р<0,05). Что касается другого медиатора воспаления IFN-γ, к 12 месяцам жизни уровень его оставался сниженным (14,4±2,99), сопоставимым с таковым в 6 месяцев жизни (13,45±2,46), что в 1,3 раза меньше уровня контроля. Сывороточный уровень IL-10 у детей в 6 месяцев жизни составил 10,08±2,74, а к 12 месяцам жизни снижался до 9,93±2,01, также превышая в среднем в 1,7 раза контрольные показатели.

Таким образом, учитывая закономерности становления иммунной реактивности в постнатальном периоде у детей, в частности в период 6 месяцев жизни, отличающихся наибольшей ранимостью организма (, , 1996), давая объективную оценку установленным естественным особенностям реагирования (не приняв за нарушения физиологические изменения иммунологических реакций), мы с осторожностью отнеслись к интерпретации выраженных сдвигов, выявленных в данном возрастном периоде. Тем не менее, суммируя представленные выше данные, можно сделать вывод о недостаточной эффективности реабилитационных мероприятий, проводимых недоношенным детям с перинатальной патологией в первый год жизни, на что указывает наличие иммунологической дизрегуляции с признаками иммунодефицита или напряжения, которые во многом предопределяют степень участия тех или иных механизмов в пролонгировании патологического процесса.

Результаты настоящего исследования подтверждают его актуальность и важность решения проблем связанных с проведением иммунологического скрининга всех недоношенных новорожденных независимо от гестационного возраста. Мониторинг иммунного статуса следует рассматривать как критерий оценки качества неонатальной помощи, оказываемой недоношенным новорожденным, целью которой на современном этапе является не только повышение выживаемости недоношенных детей, но и уменьшение неблагоприятного воздействия факторов риска развития и хронизации заболеваний у детей первого года жизни.

Рисунок 14 – Алгоритм мониторинга недоношенных детей и

характеристика становления клинического и иммунного статуса

Заключение

Результаты проведенных исследований позволили сделать следующие выводы:

1.  Недоношенные дети к моменту рождения имеют следующие особенности состояния иммунного статуса, связанные со степенью зрелости их иммунной системы и гестационным возрастом:

·  при сроке гестации 22-27 недели характерным является недостаточность хелперных и цитотоксических субпопуляций, сочетающиеся с доминированием доли общих Т-лимфоцитов (CD3+) и усилением микробицидной активности микрофагоцитарной системы при низком уровне пролиферации и апоптоза;

·  при сроке гестации 28-33 недели констатировано перераспределение клеток в сторону увеличения присутствия хелперных и цитотоксических субпопуляций Т-лимфоцитов при высоком уровне пролиферативных и апоптотических процессов с усиленной индуцированной активностью микрофагоцитарной системы;

·  при сроке гестации 34-36 недели зарегистрировано значительное присутствие общих Т-лимфоцитов с умеренной активацией регуляторных и цитотоксических клеток и усилением кислород-зависисмого метаболизма в нейтрофильных гранулоцитах при снижении бактерицидного резерва системы в целом.

2.  В структуре перинатальной патологии у недоношенных новорожденных преобладала перинатальная энцефалопатия - 50,6%, респираторная патология составила 31,2%, ЗВУР - 18,9%.

3.  Общим паттерном иммунологических расстройств при перинатальной патологии у недоношенных детей является недостаточность адаптивных процессов, сопровождающаяся значительным снижением количества функционально наиболее активных клеток, экпрессирующих рецепторы к IL-2 (CD25+) и регуляторной субпопуляции Т-лимфоцитов (CD4+) с усилением процессов апоптоза (CD95+) и активацией гуморального звена иммунитета (CD20+).

4.  Лабильность уровней цитокинов и содержание цитотоксических клеток являются интегральными показателями перестройки иммунного ответа в ответ на перинатальную патологию у недоношенных детей. Так, перинатальная энцефалопатия характеризуется значительным присутствием цитотоксических клеток и высоким уровнем IL-2 и IL-1β при низком IL-10; респираторные нарушения – повышением концентрации IFN-γ и IL-2 на фоне сниженного содержания естественных киллеров и уровня IL-10; задержка внутриутробного развития – угнетением выработки IFN-γ и IL-2 при дефиците цитотоксических клеток и повышением продукции IL-1β и IL-10.

5.  Степень иммунологических отклонений при перинатальной патологии находится в прямой зависимости от гестационного возраста недоношенного ребенка:

·  у глубоконедоношенных детей с гестационным возрастом 22-27 недели выявлен дефицит CD4+, СD20+, СD25+ с умеренным повышением CD3+ и CD8+ при истощении интерферонового звена защиты, что определяет степень иммунологических расстройств как «декомпенсированное»;

·  у недоношенных 28-33 недели гестации изменения иммунного статуса в виде восстановления уровня CD3+, повышения цитотоксических клеток на фоне гипоиммуноглобулинемии и снижения функциональной активности микрофагоцитарной системы характеризуются как «нарушенное компенсированное»;

·  у недоношенных детей с гестационным возрастом 34-36 недели формирование «субкомпенсированного» состояния сопровождается повышением концентрации IgG, CD20+, индуцированной бактерицидной активности микрофагоцитарной системы и снижением цитотоксических показателей.

6.  Установлены два варианта реализации иммунного ответа недоношенных детей с хроническим течением внутриутробной цитомегаловирусной инфекции: гипо - и гиперреактивный характер иммунных реакций.

7.  Полиморфизм генов IL-10 (rs1800896) и IL-2Rа (rs) являются одним из главных причин дисрегуляции иммунного ответа у недоношенных детей с хроническим течением внутриутробной цитомегаловирусной инфекции. В частности, для гомозиготного по аллелям А генов IL-2Rа и IL-10 установлен генетически обусловленный гиперреактивный характер иммунных реакций при ЦМВИ.

8.  Катамнестическое наблюдение за недоношенными детьми в течение первого года жизни в структуре отстроченной перинатальной патологии зарегистрировало сочетание органических и функциональных расстройств. У детей с поражением ЦНС ведущими синдромами являются синдромы угнетения (55,2%), гипертензионо-гидроцефальный синдром – 44,2%; при респираторной патологии ОРИ – 56%, бронхопневмония – 16%; при ЗВУР отставание весо-ростовых показателей в 11% случаев.

9.  В постнеонатальном периоде недоношенных детей с различными видами перинатальной патологии отмечена частая встречаемость соматической патологии: железодефицитная анемия в 40% случаев, достаточно высокий инфекционный синдром - 41,6%, белково-энергетическая недостаточность питания 27,2%, рахит в 18,1% наблюдений.

10.  Анализ мониторирования иммунного статуса недоношенных детей с перинатальной патологией на первом году жизни показал, что имеются различия в темпах регресса иммунологических отклонений в зависимости от возраста. В 6 месяцев жизни у детей ведущими звеньями дисфункции оставались цитокиновая разбалансированность, усиление цитотоксической активности лимфоцитов, Fas-индуцированного апоптоза, дефицит бактерицидной активности микрофагоцитарной системы периферической крови. К году жизни наблюдалась тенденция к восстановлению иммунного профиля (повышение CD3+, CD4+ и уменьшении цитотоксических клеток), при постоянстве регистрации фагоцитарной недостаточности.

11.  Разработанный алгоритм диспансерного наблюдения недоношенных детей с перинатальной патологией позволяет решать вопросы индивидуализации ранней диагностики и реабилитации на основе прогностической оценки последствий перинатальных расстройств путем иммунологического мониторинга состояния недоношенных детей на первом году жизни.

Практические рекомендации

1.  Для повышения качества диагностики и адекватной оценки течения инфекционного процесса у недоношенных детей в комплекс общепринятых методов обследования необходимо включать определение содержания свободных IL-1β, IL-2 и иммунного интерферона в крови, как показателей активности процессов иммуногенеза, воспаления и ранних маркеров направленности иммунного ответа.

2.  Предложенная программа диагностики нарушений функционального состояния иммунной системы при перинатальной патологии у недоношенных детей различного гестационного возраста, включающий анализ эндогенной продукции про - и противовоспалительных цитокинов, позволяет индивидуализировать оценку состояния иммунного профиля у больных детей, повысить степень прогнозирования уровня здоровья новорожденных.

3.  Выявленные факторы риска (ОАА, преэклампсия, угроза прерывания беременности (неоднократно), дородовое излитие околоплодных вод, длительный безводный период, хроническая фетоплацентарная недостаточность, хроническая гипоксия плода) по развитию перинатальной патологии у недоношенных детей должны использоваться в работе врачей ПМСП для ранней диагностики, своевременной госпитализации и проведения в дальнейшем дифференцированных видов диспансеризации и реабилитации.

4.  Прогностическими критериями осложнений и исходов перинатальной патологии (ЗВУР, церебральная и респираторная патологии, ВУИ) являются не только клинические признаки, но и иммунологический статус и показатели гемостаза (ОАК), которые могут быть использованы для ранней диагностики и соблюдения поэтапной реабилитации: стационар-санаторий – поликлиника.

5.  Выявленные различия клинико-лабораторных параметров двух вариантов внутриутробной цитомегаловирусной инфекции с хроническим течением (иммуносупрессивный и иммунореактивный) у новорожденных детей обосновывают необходимость проведения иммунологических исследований для своевременной диагностики, прогноза осложнений и исходов. Для иммунносупрессивных нарушений у недоношенных новорожденных характерны синдромы и органические поражения ЦНС, приводящие к инвалидизации детей; для иммунореактивных – атопические дерматиты, риниты и др.

6.  Разработанная программа диагностики перинатальной патологии, осложнений, исходов с использованием некоторых показателей иммунного ответа (IL-2, IL-1, IFN-γ, IL-10, IgG) необходима для оптимизации объемов лабораторных исследований, его индивидуализации в оценке состояния иммунитета у больных детей по стартовым показателям, дифференцированную реабилитацию и проведения мониторинга состояния здоровья детей.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1.  , Каракушикова микст-инфекций в структуре ВУИ //Проблемы фундаментальной науки и клинической медицины. - Алматы, 2004. - С. 220-222.

2.  , , Каракушикова характеристика внутриутробных энцефалитов //Сборник научных трудов IV Международной конференции детских неврологов Центрально-Азиатских стран «Мост между Европой и Центральной Азией – профилактика детской неврологической инвалидности в Казахстане». Приложение к журналу «Педиатрия и детская хирургия Казахстана». - Алматы, 2007. - С. 80-83.

3.  , , Байгазиева проявления желтушного синдрома у новорожденных с ВУИ //Материалы Международного конгресса «Гастроэнтерология 2007». - Алматы, 2007. - С. 17-18.

4.  , , Диканбаева течение моно и микст - внутриутробных инфекций //Материалы Республиканской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной теоретической, клинической медицины и медицинского образования», посвященной 50-летию Западно-Казахстанской государственной медицинской академии имени Марата Оспанова. - Актобе, 2007. - С. 324.

5.  , , Емельянова течения внутриутробной цитомегаловирусной инфекции в раннем неонатальном периоде //Материалы III съезда врачей и провизоров Республики Казахстан. - Астана, 2007. - С. 376-378.

6.  , , и др. Факторы риска развития внутриутробных инфекций //Вестник Казахского национального медицинского университета№1. - С. 113-115.

7.  , , Оналбаева клинической картины активной внутриутробной цитомегаловирусной и герпетической инфекции //Вестник Казахского национального медицинского университета№1, ч. II. - С. 157-158.

8.  , , Садвакасова патология у детей с внутриутробными герпесвирусными инфекциями //Материалы Научной конференции молодых ученых с международным участием, посвященной 110-летию СПб ГМУ им. академика . - СПб., 2008. - С. 37-38.

9.  Құрсақішілік жұқпалану кезінде жүкті әйелдер мен жаңа туылған нәрістелердің иммундық жүйесінің жағдайлары //Вестник КазНМУ. Специальный выпуск, посвященный памяти С. 149-153.

10.  , , Абдуллаева течения пневмонии у недоношенных детей в неонатальном периоде //Материалы XIV Международной научной конференции «Здоровье семьи – XXI век». - Римини, 2010. – С. 360-362.

11.  Каракушикова защита у недоношенных детей с церебральной ишемией в неонатальном периоде //Материалы XIV Международной научной конференции. - Римини, 2010. - С. 506-511.

12.  , , Абдуллаева недоношенных, рожденных на 22-34 неделе гестации //Материалы Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное». - СПб, 2010. - С. 157.

13.  Каракушикова -лабораторная характеристика пневмонии недоношенных детей //Республиканский научно-теоретический журнал «Наука и новые технологии»№1. - С. 92-94.

14.  Каракушикова характеристика внутриутробных инфекций у новорожденных недоношенных детей //Известия ВУЗов№1. - С. 53-55.

15.  Каракушикова неонатальной адаптации недоношенных детей с задержкой внутриутробного развития //Наука и здравоохранение№1. Том 2. - С. 158-160.

16.  Каракушикова -иммунологическая характеристика недоношенных детей с церебральной ишемией в неонатальном периоде //Наука и здравоохранение№ 1. Том 2. - С. 177-180.

17.  Каракушикова иммунного статуса новорожденного из группы высокого риска по реализации внутриутробной инфекции (обзор) //O’zbekiston tibbiyot jurnali№1. - С. 73-76.

18.  Каракушикова течения беременности у женщин из группы высокого риска по реализации внутриутробной инфекции у плода и новорожденного //O’zbekiston tibbiyot jurnali№1. - С. 83-88.

19.  Каракушикова показателей клинико-иммунологического статуса у недоношенных детей с церебральной ишемией //Батыс Қазақстан медицина журналы№1 (25). – С. 165-168.

20.  Каракушикова внутриутробного инфицирования в развитии перинатальной патологии: пути решения //Здравоохранение Таджикистана№1 (304). - С. 43-49.

21.  Қаракушикова А. С. Жаңа туылған балалардағы жатырішілік инфекция салдарынан болатын иммундық бұзылулардың ерекшеліктері //Жинақ «Медицина білімі – мемлекеттік тіл аясында». – Алматы: ТОО «Кредосс-Трейд», 2010. - С. 92-96.

22.  Қаракушикова туған нәрестелерде бейімделу кезеңінің иммунологиялық механизмдері //Жинақ «Медицина білімі – мемлекеттік тіл аясында». – Алматы: ТОО «Кредосс-Трейд», 2010. - С. 97-102.

23.  Каракушикова клинико-иммунологического статуса у недоношенных детей с церебральной ишемией //Астана медициналық журналы№2 (60). - С. 132-135.

24.  , Абдуллаева аспекты клиники и диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний у недоношенных детей //Астана медициналық журналы№2 (60). - С. 136-143.

25.  , , Абдуллаева формирования иммунного ответа новорожденных в неонатальном периоде //Медицина и экология№2. - С. 29-34.

26.  , , Абдуллаева иммунных факторов в диагностике и прогнозировании инфекционно-воспалительных заболеваний у недоношенных новорожденных //Медицина и экология№2. - С. 120-122.

27.  Каракушикова -иммунологические аспекты механизмов адаптации недоношенных детей в неонатальном периоде (обзор) //Батыс Қазақстан медицина журналы№2 (26). – С. 12-17.

28.  Каракушикова гомеостаз у недоношенных детей //Гигиена, эпидемиология и иммунобиология№2. – С. 174-176.

29.  Каракушикова иммунного статуса у недоношенных детей с церебральной ишемией //Педиатрия и детская хирургия Казахстана№2. – С. 8-11.

30.  , , и др. Функциональная активность иммунного статуса у недоношенных детей с перинатальной патологией //Здоровье и болезнь№4 (89). - С. 152-155.

31.  , Абдуллаева иммунного статуса у недоношенных детей в неонатальном периоде //Медицина№6 (96). - С. 117-121.

32.  Каракушикова состояния здоровья недоношенных детей первого года жизни в амбулаторных условиях //Медицина№6 (96). – С. 121-123.

33.  , , Абдуллаева патология у недоношенных детей: клинико-иммунологическая диагностика, лечение и реабилитация. - Алматы, - 2010. – 188с.

34.  Инновационный патент на изобретение № 000/0404.1. Способ диагностики и прогнозирования развития внутриутробной пневмонии у недоношенных новорожденных / : Официальный бюллетень «Промышленная собственность. Изобретения. Полезные модели». – Астана, 2010.

35.  Инновационный патент на изобретение № 000/0405.1. Способ диагностики церебральной ишемии у недоношенных новорожденных / , : Официальный бюллетень «Промышленная собственность. Изобретения. Полезные модели». – Астана, 2010.

36.  Инновационный патент на изобретение № 000/0496.1. Способ оценки неонатальной адаптации недоношенных детей, рожденных с задержкой внутриутробного развития / , , : Официальный бюллетень «Промышленная собственность. Изобретения. Полезные модели». – Астана, 2010.

37.  Инновационный патент на изобретение № 000/0846.1. Способ диагностики перинатального поражения центральной нервной системы инфекционного генеза у детей первых 6 месяцев жизни / Ан О. О., , : Официальный бюллетень «Промышленная собственность. Изобретения. Полезные модели». – Астана, 2010.

Қаракушикова Айгүл Сәдуақасқызы

Шала туылған балалардағы перинатальдық патологияның иммунологиялық аспектілері

14.00.36 – аллергология және иммунология мамандығы бойынша

медицина ғылымдарының докторы ғылыми дәрежесін алу үшін дайындалған диссертация

Тұжырым

Жүктіліктің түрлі кезеңдерінде шала туылатын балалардың иммундық статусын зерттеудің өзектілігі нәрестелік бейімделу кезеңіндегі патогенездік механизмдердің күрделілігіне байланысты болып келеді. Шала туылған балалардағы иммундық-цитокиндік жүйенің қалыптасу ерекшеліктері мен оның реттелуіндегі бұзылыстарды анықтау перинатальдық патологияның сан алуан түрлерін диагностикалауға және неонатальдық кезеңнен кейінгі шақтың ағымдық сипатын болжауға мүмкіндік береді.

Зерттеудің нысаны жүктіліктің түрлі кезеңдерінде (22 апта мен 36 апта аралығында) шала туылған, неонатальдық кезең сәтті өткен және перинатальдық патологиясы бар 325 бала болып табылады.

Мақсаты: неонатальдық кезеңнен кейінгі өмір ағымын болжау мен диагностикасын кемелдендіру үшін иммундық-цитокиндік реттелудің қалыптасу заңдылықтары мен ондағы ауытқушылықтарды зерттеу негізінде жүктіліктің түрлі кезеңдерінде шала туылған балалардың перинатальдық сырқаттануының патогенезіндегі иммундық қызметтің бұзылуының мән-маңызын айқындау.

Зерттеу әдістері. Шала туылған балаларды клиникалық тексеру сәбидің жағдайын бағалаудың Апгар, Ballard, Silverman, , шкалалары бойынша жалпыға бірдей схемаларымен жүзеге асырылды. Туу тарихтары, алмасу карталары, жаңа туылған нәрестенің даму тарихтары, дамудың медициналық карталары, науқастардың ауруханалық сырқатнамалары проспективті талдаудан өтті. ИФА және ПЦР құрсақішілік цитомегаловирустық инфекцияларды диагностикалау үшін қандағы лимфоциттердің сандық құрамын анықтау моноклональдық антиденелер панелін пайдалана отырып, қиғаш иммунофлюоресценция әдісімен жүзеге асырылды. Микрофагоцитарлы жүйенің функционалдық жағдайы НКТ-тест (Park B. N.) – нитрокөк тетразолийдің қалпына келу тестінің көмегімен бақыланды. Цитокиндер мен иммуноглобулиндердің концентрациясы қатты фазалық энзим-байланысты иммуносорбентті талдау әдісімен өлшенді. Құрсақішілік цитомегаловирустық инфекция жағдайындағы жоғары не төмен иммундық қорғанысқа генетикалық бейімділікті анықтау гендік типтендіру әдісімен реалды уақыт режімінде (ПЦР-real time) бәсекелес Taq-Man-түтіктерді пайдалана отырып жүргізілді.

Мәліметтерді талдау мақсатында көп өлшемді статистика, сызықтық корреляциялық, дискриминанттық, кластерлік талдау әдістері қолданылды.

Жұмыс нәтижелері мен негізгі сипаттамалары. Иммунитет көрсеткіштерінің тұрақсыздық деңгейінің жүктілік жасына байланысты өзіндік ерекшеліктері болатындығы анықталды және олар жүктіліктің 34-36 апта мерзімінде иммундық статустың шала икемделген бұзылыстарынан, жүктіліктің 28-33 аптасына тән икемделген ахуалдан, жүктіліктің 22-27 апта мерзімінде анықталған икемделмеген бұзылыстарынан аңғарылады. Шала туылған балалардағы құрсақішілік цитомегаловирустық инфекцияның созылмалы ағымында болатын иммундық ығысу нұсқалары (гипо - және гиперреактивтік иммундық жауап) айқындалды. Шала туылған балалардың иммундық статусының мониторингі цитокиндік тепе-теңдіктің ауытқуы, лимфоциттердің цитотоксиндік белсенділігі мен Fas-демелген адаптоздың күшеюі, қанның шеткері микрофагоцитарлық жүйесіндегі бактерицид белсенділігіне деген зәрулік 6 айдағы функционалдық бұзылуларының жетекші қатары болғандығын көрсетеді.

Қолданбалық деңгейі. Қазақстан Республикасының өнертапқыштық инновациялық 4 патенті алынды (№ 000/0404.1, № 000/0405.1, № 000/0496.1, № 000/0846.1). Жүргізілген зерттеулерден алынған мәліметтерді қалалық және облыстық (Алматы, Петропавл, Қызылорда, Шымкент) балалар мекемелері мен босандыру медицина ұйымдарының неонтологтары мен педиатрлары қолданады. Зерттеу материалдары атындағы ҚазҰМУ-дың емдеу факультеті, бала аурулары кафедрасы неонтология курсының және Қалалық медицина колледжінің (Қызылорда қаласы) оқу бағдарламаларына қосылған.

Қолдану саласы. Педиатрия, неонатология, клиникалық иммунология, инфекциялық аурулар, генетика.

Жұмыстың маңыздылығы. Әртүрлі гестациялық жастағы шала туылған бала денсаулығын бағалаудың диагностикалық және болжамдық белгілері ұсынылды. Патологиялық үдерістің сипатын, тереңдігі мен дамуын дұрыс бағалауға мүмкіндік туғызатын шала туылған баланың иммундық статусын бағалаудың кешенді тәсілі қажет екендігі дәлелденді. IL-10 генінің rs1800896 және IL2Rа генінің rs полиморфтық локустарының ассоциациясын анықтау шала туылған балаларда созылмалы жатырішілік цитомегаловирустық инфекцияның ағысын болжаудың жаңа мүмкіндіктеріне жол ашты.

Зерттеу нысанының дамуы туралы болжам. Перинатальдық патология барысында әртүрлі гестациялық жастағы шала туылған балалардың иммундық жүйесінің функционалдық жағдайының бұзылуына диагностика жүргізу ауру баланың жағдайын жеке бағалауға, бала денсаулығының деңгейін диагностикалау мен болжау сапасын арттыруға мүмкіндік береді.

Karakushikova Aigul Sadvakasovna

Immunological aspects of perinatal pathology in premature children.

Dissertation for defend of medical sciences doctor’s degree.

14.00.36 – allergology and immunology.

Summary

The actuality of the study of immune state in premature children at different terms of gestation is in the complexity of pathogenetic mechanisms during neonatal adaptation period. Revealing the formation peculiarities of immunocytokinic system in premature children, disorders of its regulation allows to perform reliably the diagnosis of different types of perinatal pathology and to prognose the character of the postneonatal period course.

The object of the study. 325 premature newborns, delivered in different terms of gestation (from 22 up to 36 weeks) with favourable course of neonatal period and with perinatal pathology.

The purpose: to determine a significance of immune dysfunction in pathogenesis of perinatal pathology in premature children of different gestational age on the basis of studying immunocytokinic regulations and its disorders for improving the diagnosis and prognosing the course of postneonatal period of life.

The methods of the study. Clinical examination of premature children was performed due to standard schemes of evaluating a child’s condition by Apgar, Ballard, Silverman, Dementyeva G. M., Ivanova O. D. scores. There was carried out a prospective analysis of labor histories, metabolic cards, histories of newborns deliveries, medical cards of development, case histories of stationary patients. Diagnosis of IFA and PCR intrauterine cytomegaloviral infections. Determining of blood lymphocytes compound number was performed by indirect immunofluorescence method with using panels of monoclonal antibodies. Functional condition of microphagocytary system with the help of nitroblue tetrazoly restoration test - NBT - test (Park B. N.).

Concentration of cytokines and immunoglobulines was measured by method of enzyme – linked immunosorbent assay. Determining a genetic predisposition to increased and decreased immune response at intrauterine cytomegaloviral infection was carried out by method of genotyping uninucleotide substitutes in IL-1Ra (rs 4251961), IL - 2Ra (rs ) and IL-10 (rs 1800896) genes was performed in regimen of real time (PCR-real time) by using concordance Tag Man - probes, complementary polymorphic areas of DNA.

For data analysis the methods of multi-measuring statistics, linear correlation, discriminate, cluster analyses were used.

The results and basic characteristics of the work.

There was determined, that the degree of immunity indices degree has its own peculiarities, depending on gestation age and it is developed by subcompensated disorder of immune state for a term of 34-36 weeks gestation; disorder of compensated condition, typical for 28-33 weeks of gestation; decompensated disorder in a term of 22-27 weeks of gestation. Studying an immune state of premature children in immunological disorders revealed: insufficiency of adaptive processes, accompanying by significant decrease of the number of more functionally active cells, expressing receptors to IL-2 (CD25+) and regulatory subpopulation T-lymphocytos (CD4+) with strengthening of apoptis processes (CD95+) and activation of humoral immune component.

The degree of introduction. We have got 4 innovation patents of RK for inventions. (№ 000/ 0404.1, № 000/ 0405.1, № 000/ 0496.1, № 000/ 0846.1). The obtained data of performed studies are used in clinical work of neonatologists and pediatricians of city and oblast medical organizations (Almaty, Petropavlovsk, Kzylorda, Shymkent).

The are included into a program of studying students and clinical chairs of children diseases of S. D. Asfendiyarov KazNMU therapeutical department and city medical college (Kzylorda).

The field of application. Pediatry, neonatology, clinical immunology, infectious diseases, genetics.

The significance of the work. There were suggested diagnostic and prognostic criteria of premature children health state evaluation of different gestation age. Revealing associations of polymorphic locuses rs 1800896 of IL-10 and rs , IL-2Ra genes gives new perspectives in prognosing the course of chronic intrauterine cytomegaloviral infection in premature children. Prognosis of intention for development of the study object.

Prognosis of intention for development of the study object.

Diagnosis of functional immune system state disorders in premature children of different gestation age in perinatal pathology allows to perform an individual evaluation of sick children state, to increase the quality of diagnosis and prediction of children health level.